Jeremy C. Shia、Masayo Yabu、Kim Van Tran和Michael S. Young
沃特世公司(美國馬薩諸塞州米爾福德)

應用優勢

♦ 與現有HILIC方法相比，大大改善了百草枯和敵草快的保留性能和分離度。

♦ CORTECS™ UPLC^® HILIC色譜柱可以在百草枯和敵草快之間實現基線分離，允許MS和UV檢測使用相同的色譜參數。

沃特世解決方案
ACQUITY UPLC^® H-Class 系統
ACQUITY^® TQD 質譜儀
CORTECS UPLC HILIC 色譜柱
Oasis^® WCX 小柱

關鍵詞
敵草快，百草枯，UPLC/MS/MS，UPLC/UV，SPE，飲用水，HILIC，CORTECS

簡介
敵草快和百草枯是帶雙電荷的季胺鹽類除草劑(圖1)。它們在世界范圍內被廣泛用于控制農作物和水生雜草。美國環保署(EPA)規定的飲用水中最高污染物水平(MCL)為20 µg/L (20 ppb)。百草枯被EPA列為限用農藥。為了保證飲用水質量，歐盟(EU)委員會規定單一除草劑的下限為0.1 µg/L (100 ppt)¹。2007年繼瑞典當局裁定一項法案之后，歐盟也禁止再繼續使用百草枯。敵草快和百草枯的極性都很強，難以在C₁₈色譜柱上使用反相液相色譜法保留。大多數已發表的方法，包括美國EPA方法549.2，都需要往流動相中添加己烷磺酸鈉鹽等離子對試劑，才能在這兩種季銨鹽分析物中實現所需的保留時間和分離度。為了滿足歐盟等國家和機構規定的極低的定量要求，質譜(MS)成為了必要的檢測手段，然而離子對試劑的使用會對MS檢測產生顯著的離子抑制作用。作為一種替代技術，親水性相互作用色譜(HILIC)與離子對色譜相比具有一定優勢。由于無需添加離子對試劑，MS離子化效率得到提高。其次，提取液中有機溶劑含量通常很高，可以不經含有離子對試劑的水相流動相稀釋直接進入色譜柱中。本應用紀要中演示了使用CORTECS UPLC HILIC色譜柱進行UPLC分離能夠顯著改善兩種分析物的保留時間和分離度，使得僅用UV一種檢測方法就能實現最低500ppt的檢測。

實驗

樣品描述
首先，將自來水用硫代硫酸鈉進行脫氯處理。加入磷酸銨，將所有樣品的pH值調整至7左右。然后，將樣品加載到Oasis WCX小柱上。通過蒸發和濃縮減小SPE洗脫液的體積，實現樣品富集。詳細的SPE步驟如圖2所示。

UPLC條件
系統： 配有光電二極管陣列(PDA)檢 測器的ACQUITY UPLC H-Class系統
色譜柱： CORTECS UPLC HILIC 1.6 µm， 2.1 x 100 mm(部件號186007106)
流動相(等度)： 50:50 A/B
流動相A： 200 mM甲酸銨緩沖液，pH 3.7
流動相B： 乙腈
進樣體積： 20 µL
柱溫： 30 ℃
Wash溶劑：乙腈/水(50:50)
Purge溶劑：乙腈/水(50:50)
流速： 0.5 mL/min
PDA 檢測條件： 敵草快為UV 308 nm，百草枯為UV 257 nm        
樣品瓶： 聚丙烯自動進樣器樣品瓶 (部件號186002642)
表1總結了本次研究中使用的MRM通道和LC/MS參數。

試劑
1. pH調節濃緩沖液(400mM磷酸鹽緩沖液，pH 7)準確稱量23 g磷酸二氫銨，加入500 mL容量瓶中。加入水  (Milli-Q或同等試劑)使之完全溶解，然后稀釋至約400 mL。加入氫氧化銨溶液調節pH值至7.2。用水稀釋至標線。
2. SPE活化和清洗溶液(10 mM pH 7磷酸鹽緩沖液)取10 mL上述400 mM pH 7濃縮緩沖液，用水稀釋至400mL。
3. SPE 洗脫液(10:90甲酸/乙腈)將50 mL甲酸加入450 mL乙腈中并充分混合。

MS條件
質譜儀： ACQUITY TQD
電離模式： 電噴霧正離子
源溫度： 150 °C
脫溶劑氣溫度： 350 °C
脫溶劑氣流速： 800 L/h
錐孔氣體流速：30 L/h
碰撞氣體流速：0.20 mL/min
數據管理： MassLynx^®軟件

樣品制備
注：樣品收集和所有樣品制備步驟均應使用聚丙烯容器。建議使用聚丙烯自動進樣器樣品瓶(部件號186002642)進行UPLC分析。
1. 樣品預處理
2. SPE富集和凈化

將10 mL樣品移至適當的聚丙烯容器中(本實驗中使用的是15 mL離心管)。如果樣品已經氯化，加入20 mg/mL硫代硫酸鈉50 µL并充分混合。向所有樣品加入400 mM pH 7磷酸鹽緩沖液25 µL以調整pH值。用Oasis WCX小柱進行SPE富集和凈化(有關SPE詳情，請參見圖2)。在每個小柱上連接一個30 cc聚丙烯儲液瓶(部件號WAT011390)用來加載10 mL樣品。

結果與討論
在此前的一篇出版物中²，使用ACQUITY UPLC BEH HILIC色譜柱對飲用水中的敵草快和百草枯進行了分析。該方法使用MS檢測，靈敏度很高，LOQ值為40 ng/L。然而使用UV做檢測器時敵草快和百草枯無法達到基線分離(圖3A)。當CORTECS UPLC HILIC色譜柱使用相同的儀器參數時，兩種化合物的保留性能和分離度均有提高(圖3B)。因此，使用CORTECS UPLC HILIC色譜柱不僅可以使用MS檢測，也可以使用UV檢測。為了優化峰形和分析時間，將流動相A中甲酸銨緩沖液的最終濃度從150 mM提高至200 mM，并將流動相組成由40:60 A/B調整為50:50 A/B。

圖4所示為自來水樣品加標500 ng/L敵草快和百草枯的典型UPLC/UV色譜圖。UPLC結合串聯MS技術的靈敏度遠高于UV檢測，因此可以檢測的濃度達到50 ng/L。圖5顯示了自來水樣品加標50 ng/L敵草快和百草枯的典型UPLC/MS/MS色譜圖。表2和3分別顯示了加標500 ng/L和50 ng/L的水樣重復分析的回收率數據。MS檢測和UV檢測的典型基質匹配校準曲線均為線性。MS檢測校準標準為25到2000 ng/L，UV檢測則為100到5000 ng/L。校準曲線如圖6(UV)和圖7(MS/MS)所示。

UV檢測方法的性能
按照US EPA 方法549.2中定義的方法檢測限(MDL)，利用以下公式評估方法性能：MDL = S t_{(n-1, 1-alpha = 0.99)}

其中：t_{(n-1, 1-alpha = 0.99)}= 置信度為99%且自由度為n-1時的t檢驗值
n =重復次數(7)
S =重復分析的標準偏差

表4匯總了自來水樣品加標500 ng/L的UV分析回收率數據計算得到的MDL結果。該方法性能等于或優于EPA方法549.2。

結論
借助CORTECS UPLC HILIC色譜柱優異的保留性能和分離能力，敵草快和百草枯的色譜峰實現了基線分離。這使得串聯MS或UV可以使用相同的色譜參數進行檢測。通過UPLC與串聯MS的結合，使方法的靈敏度足以滿足當兩種化合物濃度僅為0.1 µg/L時的嚴格靈敏度需求。僅使用UV檢測器的方法所表現出的性能優于EPA方法549.2。

參考文獻
1. Official Journal of the European Communities: Council Directive 98/83/EC on the quality of water intended for human consumption (November 1998).
2. Van Tran K, Shia JC, Young MS. Fast and Sensitive UPLC/MS(MS) Determination  of Diquat and Paraquat in Drinking Water. Waters Application Note  720004220en. 2012 January.

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