Mary E. Lame、Erin E. Chambers和Kenneth J. Fountain
沃特世公司（美國馬薩諸塞州米爾福德）

應用優勢
■使用CORTECS™ UPLC®色譜柱有利于獲得較窄的峰寬、改善靈敏度和分離度，并消除基質干擾
■ 采用Oasis®WCX（一種混合型吸附劑）的SPE方法降低了基質干擾并提高了血漿中緩激肽提取的選擇性
■ Oasis μElution96孔板可濃縮樣品，并在最大程度上減少肽損失，使血漿中緩激肽的檢測限達到5 pg/mL
■ 選擇性高的快速SPE提取（<30 分鐘）省去了耗時的免疫親和純化步驟
■ Xevo®TQ-S MS可實現與免疫檢測方法相匹配的高靈敏度，但與后者相比更加省時省力
■ 與傳統LBA方法相比更為準確精密
■ 分析速度快，只需3.5分鐘，大大提高了工作效率

沃特世解決方法
ACQUITY UPLC®系統
Xevo TQ-S質譜儀
CORTECS UPLC C₁₈色譜柱
Oasis WCX 96孔µElution提取板
ACQUITY®96孔收集板

關鍵詞
生物分析，Oasis，樣品制備，肽定量，緩激肽，UPLC，CORTECS，血漿

簡介
緩激肽是一種含有9種氨基酸的生理和藥理活性肽，由蛋白質的激肽基團衍生而來（圖1）。激肽是可以促使血管舒張、血管通透性增強、一氧化氮釋放和花生四烯酸流動的效應因子。它是血壓、腎功能和心臟功能的重要調節因子，還參與炎癥反應¹。緩激肽可引起血管擴張，從而導致血壓降低。因此，對這種激素肽的變化進行高靈敏度、高選擇性和高準確度地定量，并將其作為疾病進展或藥物治療的評估指標，將會極為有利。盡管以往都是通過配體結合試驗（LBAs）對生物制劑進行定量分析，但在過去幾年中利用LC-MS/MS分析大分子已成為一種趨勢。這在某種程度上是因為LBAs產生顯著的交叉反應問題并且缺乏標準化。LC-MS/MS具有多種優勢，例如開發時間更短、準確度和精度更高、可重復進樣，并且容易區分相似度很高的類似物、代謝物或內源性干擾物。常見的肽通常難以通過LC-MS/MS進行分析，這是因為其不易離子化以及不易產生理想的碎片離子而導致MS靈敏度較低，從而使得LC和樣品制備方法開發非常困難。由于緩激肽在血漿中的濃度低至pg/mL水平且代謝速度快，在采血和樣品制備過程中還可通過蛋白水解人為生成，因此對其進行準確定量相當困難。

本研究采用了專門設計的血液收集技術以防止體外緩激肽的形成，并且利用混合型固相萃取（SPE）和高效實心核顆粒色譜柱，最大限度降低并消除基質干擾的同時提高定量分析的靈敏度。

簡介

方法條件
系統：ACQUITY UPLC
色譜柱：CORTECS UPLC C₁₈ 1.6 µm，2.1×50mm
流動相A：0.1%甲酸水溶液
流動相B：0.1%甲酸乙腈溶液
梯度：見表1
柱溫：35攝氏度
樣品溫度：15攝氏度
進樣體積：10 µL
總運行時間：3.5 min
收集板：Waters 1 mL ACQUITY收集板

MS條件
MS系統：Xevo TQ-S
電離模式：ESI+
毛細管電壓：3.0 kV
脫溶劑氣溫度：500攝氏度
錐孔氣流速：150 L/h
脫溶劑氣流速：1000 L/h
碰撞室壓力：3.58×10（-3）mbar
碰撞能量：按組分優化，見表2
錐孔電壓：按組分優化，見表2

數據管理
色譜軟件：UNIFI®1.6
定量軟件：UNIFI 1.6

數據管理
樣品預處理

將10 μL內標（IS）賴氨酸 -（脫-精氨酸9）- 緩激肽（10 ng/mL）加入200 μL人血漿中并混合。然后使用5% NH4OH水溶液對樣品進行1:1稀釋并混合。

使用Oasis WCX提取樣品
根據圖2所示方案提取預處理的血漿樣品。所有溶液按體積計。對μElution板上放置樣品的孔實施全部提取步驟。

結果與討論

質譜分析
在m/z 531和m/z 354觀察到緩激肽的2+和3+母離子。緩激肽（圖A）和IS（圖B）的3+母離子的典型MS/MS譜圖如圖3所示。在方法開發過程中，記錄了一些不同的多電荷母離子和碎片離子。最終使用了緩激肽和IS的3+母離子，因為它們在基質中強度最高且選擇性最佳。選擇m/z 419.18y31+的碎片離子作為緩激肽定量分析的主要碎片離子。選取3+母離子和m/z 408.18 b41+碎片離子用于確證。對于IS，選擇了m/z 344.94的3+母離子和m/z 386.03 b72+碎片離子。最佳MS條件如圖2所示。盡管許多肽可以生成小于m/z 200的較強碎片離子，但在提取樣品中這些離子（通常為亞胺離子）由于缺乏特異性，會導致高背景噪音。在此檢測中，采用m/z值大于其母離子的高特異性b或y碎片離子顯著提高了特異性，便于使用更為簡單的LC和SPE方法。

UPLC分離
與小分子不同，肽在全多孔顆粒中的傳質性能較差。因此，在生物分析研究常用的較高流速下，使用實心核顆粒填充的色譜柱可獲得更清晰的峰形^2,3。與全多孔顆粒色譜柱相比，在使用CORTECS UPLC C₁₈色譜柱時，緩激肽所得到的峰寬更窄、拖尾現象減少、峰高和峰面積更大。利用CORTECS UPLC C₁₈色譜柱得到的緩激肽和IS的峰寬為2.5-3.0秒，而在全多孔色譜柱中峰寬為4秒。使用CORTECS UPLC C₁₈色譜柱得到的緩激肽和IS的典型色譜圖如圖4所示。

樣品制備
將人血漿收集到含有EDTA和蛋白酶抑制劑的試管中，以防止體外形成緩激肽。使用Oasis WCX（一種混合型吸附劑）進行SPE提取，提高提取的選擇性。此吸附劑依靠反相和離子交換保留機制將復雜血漿樣品中的緩激肽與其它高豐度多肽選擇性地分離開來。Oasis μElution96孔提取板可在無需蒸發和復溶的條件下富集樣品。這不僅節省了時間，還減少了由于蒸發過程中收集板壁的吸附而導致的肽損失。預處理和清洗步驟的優化對于在樣品預處理和SPE提取中完全回收緩激肽至關重要。使用酸或堿對樣品進行預處理可降低粘度并增加與吸附劑的接觸時間，有利于抑制蛋白質結合，還可以通過離子交換功能使肽在SPE設備中得到更好的保留。在最初的方法開發中，通過用酸預處理血漿獲得了約80%的回收率。由于緩激肽是一種堿性的極性肽，其PI值為12.0，HPLC指數為47.8，因此懷疑它在最初的上樣步驟中發生了部分洗脫。當使用堿進行預處理時，回收率增加至約90%，這有利于在上樣步驟中通過離子交換改善緩激肽的初始保留性能。將清洗步驟2中的乙腈溶液由20%變為10%，消除了清洗過程中緩激肽的穿透現象，并使回收率提升至100%。在上樣前對血漿進行堿預處理的優化SPE方案與采用10%乙腈溶液的優化清洗步驟相結合，實現了緩激肽的完全回收，且基質效應小于10%。此外，由于UPLC分離在反相色譜進行，因此利用離子交換實現的肽分離為整個方法賦予了正交性。

線性、準確度和精度
為了生成標準曲線，用以下最終濃度的緩激肽對人血漿進行強化：5、20、30、60、100、200、400、600、1000、2000、6000和10000 pg/mL。在人血漿中制備以下濃度的質量控制（QC）樣品：25、80、250、800和5000 pg/mL。使用賴氨酸 -（脫-精氨酸9）- 緩激肽（最終濃度為0.5 ng/mL）作為緩激肽的內標（IS）。計算分析物峰面積與IS峰之間的峰面積比（PAR）。使用校準樣品的PAR并應用單一濃度（1/x）加權線性回歸模型構建人血漿樣品的校準曲線。然后根據校準曲線，通過PAR值計算出所有QC樣品的濃度。由于存在內源性緩激肽，因此采用標準品加入法。通過計算x軸截距確定對照血漿樣品中緩激肽的平均基底濃度。然后，將緩激肽的基底濃度加入到所有標曲濃度和QC濃度，以實現準確定量。使用1/x回歸，緩激肽所得曲線呈線性，R²值>0.99。表3所示為標準曲線性能匯總。QC分析結果示于表4中，內源性緩激肽和QC的典型色譜圖如圖5所示。所有濃度的QC樣品都表現出極好的準確度和精密度，滿足了有關LC-MS/MS檢測的生物分析方法驗證最佳實踐白皮書中建議的FDA可接受標準^4,5。人血漿中緩激肽的平均內源性基底濃度測得為79 pg/mL，SD和CV%分別為4.4和5.5。以上數據證實了這是一種穩定且可重現的方法。

預分析收集和處理的重要性
對血漿中的緩激肽進行準確定量十分困難，因為緩激肽可以在采血和樣品制備中經蛋白水解過程而生成^1,6,7。本研究特別注重血液收集方案，通過添加蛋白酶抑制劑以防止體外緩激肽的形成。在圖6中，A圖和B圖顯示出，如果采用同一供體和相同的收集方案，將血液收集到分別添加和未添加蛋白酶抑制劑的EDTA試管中，緩激肽的濃度從90 pg/mL升至250 pg/mL。通過使用來自供應商的另外兩個供體的未指定樣品收集方案，緩激肽的人為形成得到進一步證實，如圖6（圖C和圖D）所示。在上述情況下，將血液樣品收集到不含蛋白酶抑制劑的EDTA試管中，濃度達到了較高的ng/mL水平。這些結果進一步證明了合適的樣品收集方式對于準確定量內源性緩激肽血漿濃度的必要性。

結論
本研究開發了一種用于提取人血漿中緩激肽的混合模式SPE提取方法。μElution SPE提取板消除了蒸發操作需求，并且利用非特異性結合和樣品濃縮而大大降低了損失的可能性。通過一種快速、簡單、分析級的LC方法將緩激肽與相似度很高的內源性干擾物分離開來，LC總運行時間僅為3.5分鐘。與傳統的C₁₈全多孔色譜柱相比，CORTECS UPLC C₁₈實心核顆粒色譜柱改善了峰形，提高了緩激肽檢測的靈敏度。CORTECS UPLC C₁₈色譜柱、混合型弱陽離子交換SPE以及m/z較高的b或y MS碎片離子的聯合使用提供了理想的選擇性和靈敏度水平，從而實現了準確定量并從200 μL血漿中區分緩激肽濃度細微差異。標準曲線在5-10000 pg/mL的范圍內準確精密。在高于基底濃度的情況下可精確定量的緩激肽最低濃度為5 pg/mL。所有濃度的QC樣品均符合FDA法規標準^4,5，平均準確度范圍為99.8-106.8，平均CV%為0.5-5.5。以上數據證實了這是一種準確且可重現的方法。本研究還證實了采用合適的蛋白酶抑制劑樣品收集方式對于準確測定緩激肽內源性濃度的重要性。此外，如果需要執行進一步驗證，本方法在通過LC-MS/MS對PK和臨床研究的患者樣品進行高靈敏度的緩激肽定量方面也表現出巨大的潛力。

參考文獻
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致謝
感謝Jeffrey Widdos和Biological Specialty Corporation為本研究所用人血漿的收集提供的服務和協助。