實驗常見問題解答匯集(一)

BSP甲基化擴增得到的PCR產物可否直接測序，為什么需要構建TA克隆后測序？

由于基因組DNA的每個CG位點甲基化程度各不相同，未發生甲基化的C會被重亞硫酸鹽修飾成為U，而C若發生甲基化則不變，這樣如果進行PCR產物測序就有可能在原有的C位點得到雙峰圖，無法確定甲基化的程度，必需通過回收PCR產物，進行TA克隆，隨機挑選5-10個單克隆測序的方式才能計算獲得每個CG位點的甲基化情況。

如何提高哺乳動物細胞的轉染效率？

對于生物技術科研實驗，擬將外源基因（或DNA序列）導入到體外培養的細胞中（尤其是各類哺乳動物細胞），讓外源基因在細胞中進行表達甚至翻譯，到達預期目的，那么除了保障攜帶基因的質粒載體上具備高表達元件（啟動子、增強子、終止子等）之外，另外一個重要因素是讓外源基因的轉染效率達到極高值，尤其對于基因干擾研究實驗而言，達到80%以上的轉染效率，是干擾評價實驗順利完成的前提保證。

關于如何提高轉染效率，以下是銳賽團隊實踐一些心得，系統整理如下

1、細胞本身的狀態的重要性占著70%以上的比重。那么細胞生長狀態體現哪些方面
1）細胞周期：分裂期細胞往往要比靜止細胞更易于攝取并表達外源DNA。因此，細胞都在轉染當天或前一天鋪板。同樣重要的是細胞在種板進行轉染時不應處于過度生長的狀態；此外對于原代細胞，還常用促有絲分裂刺激物（如病毒轉化，生長因子，條件培養基等）來活化。所以要觀察293系列細胞在鋪板后多長時間（12h?18h?24h?）到達分裂期，但又不能是過度生長狀態！
2） 細胞融合率（密度數量）：只要培養基質（培養皿）尚有空間，細胞就會按指數規律分裂。對于正常細胞而言，細胞生長的速度受細胞密度大小的接觸抑制（癌細胞則不受此限制而會繼續生長并可互相疊加）。營養的耗竭以及代謝廢物的積聚會影響所有的細胞生長，細胞會因為缺乏營養而不適于轉染。個人認為一般293系列細胞鋪板50%密度，16-20h達70%可以轉染，切忌貼壁就轉染！
3） 傳代次數：傳代次數是指對一個細胞系進行分批傳代的頻度（通常在一個實驗室范圍內）。某些細胞系相比較其他細胞系而言較不穩定，可能會隨著培養時間的延長而改變，視不同的細胞系和培養條件而定，因此名稱相同的同一細胞系在生理學和形態學（以及轉染能力）性質也可能會有很大差異；另外分板傳代培養時把貼壁細胞用胰蛋白酶消化，這個常規操作可導致正常細胞功能受到嚴重損害，因此要重視轉染前細胞的鋪板操作優化（如胰蛋白酶消化時間的長短、胰蛋白酶的滅活等）。教科書上說，細胞在凍存復蘇后的一兩代之內或直到它們完全復蘇之前都很難轉染。
4） 貼壁與懸浮：在轉染效率方面貼壁細胞和懸浮細胞之間的差異顯著。相對于貼壁細胞（如HEK，CHO），懸浮細胞（如HL 60，Jurkat）非常難以轉染，可能是因為細胞間膜結構的差異，但目前還沒有分子水平上合理機制的解釋。
2、質粒載體DNA的質量也是轉染好壞的重要因素
1)一般原則：對純化所得的載體進行質量鑒定，在轉讓時一定要選用一種已知具有功能的載體做對照。
2)載體的完整性：書面報告中核實載體元件（啟動子/增強子/ORI等等）。
3) 載體的制備質量：純化質量情況，是否有其他載體交叉污染，制備產物中殘余的污染物（如氯仿、酒精、CsCl、內毒素）可能會影響轉染效率。
3、培養條件影響細胞轉染實驗的成敗
1） DNA-轉染試劑復合物：轉染操作中復合物稀釋液的PH值變化很重要（個人經驗：某次轉染一批細胞中，有一孔的稀釋液與其他的不是同一管，結果感覺此孔的熒光比其他較強。 但是要得出結論需要反復驗證，排除細胞狀態差異，隨機差異）。注意觀察培養基顏色。
2） 培養基的“新鮮”：保證培養基的新鮮，忌諱轉染實驗時更換培養基體系，盡量減少試劑或添加劑的變更。
3 )營養的保證：血清、二氧化碳濃度稍微變化，會對結果有很大影響。
4 )杜絕有任何可能性污染時進行轉染實驗：化學物質、細菌、真菌的污染，還有細胞與細胞的交叉污染。

用同樣一個病毒載體系統進行病毒包裝實驗，為什么有人做的很好，次次成功，有人卻是時常做不出來,穩定性很差，不是滴度低就是根本不出毒?

從我們對不同載體系統病毒包裝的多年經驗總結，主要以下幾個方面心得

第一，病毒包裝的幾個關鍵節點就是細胞因素、載體系統（盡量使用成熟的商業化載體系統）、構建重組的質粒正確與否、質粒抽提純化情況、包裝轉染控制（24、48小時的細胞及熒光狀態判斷）、目的基因對病毒包裝影響（基因大小、序列情況、蛋白功能毒性等都會影響到是否能包裝成功）。
第二，如果有細胞培養和細胞轉染實驗的常規經驗，細胞因素應該沒有什么問題（細胞培養人員一定要關注，包裝或轉染感染前一定要重視細胞干凈細微污染與否、飽滿立體感是否好、鋪板均勻細胞密度適中否），細胞產毒出毒期間過程中的活力是包裝正常和出來的病毒滴度高低的一個重要環節（正常包裝出病毒情況，慢病毒、逆轉錄病毒包裝一個細胞出一個病毒顆粒，腺病毒是1000個，腺相關病毒是10000個），所以實踐操作表明，病毒包裝轉染時細胞的密度要控制，使得收毒（72小時）時細胞密度在90%-95%左右。
第三，建議使用商品化的成熟毒載體系統（不要用來路不清或基本被淘汰很少人在使用的系統），從文獻和我們多年的實踐可以結論，這類系統是穩定的，因而分析原因時盡量少花精力在對載體系統的驗證上，這樣會白花力氣。
第四，至于包裝轉染時的操作控制細節及其轉染試劑因素，只要在操作時按相關使用說明和操作步驟，應該沒有大問題，所以也不要白花太多精力在這上面。
第五，另一個需要重點關注和排查的因素就是目的基因的表達載體構建和抽提純化環節，是否構建時導致質粒載體重組或某個部件缺失，或污染別的質粒或雜物？中抽純化是否污染？是否抽提的是別的質粒？要養成同時做陰性對照的習慣（是否目的基因載體和陰性對照GFP載體是同一批，建議同一批，建議每次包裝都如此操作），如果這個環節沒有啥問題，在構建中出現重組和缺失、或抽提純化失敗的可能性也不大。
第六，落實了上面那些因素，那就是最后一個原因，目的基因的大小、序列情況、該目的蛋白的功能毒性等導致無法包裝成功（實踐中，這種情況是有的，我們偶爾會遇到，可能原因是一些基因表達翻譯后對包裝細胞產生毒性，導致細胞狀態異常），那么我們能做的就是換病毒包裝載體系統，嘗試其他載體系統能否包裝出來。不過這種情況出現的幾率非常低，你做上100個基因，也可能碰不上一個。
因而總的來說，我們進行病毒包裝實驗時要重視包裝材料——細胞及表達質粒（對拿過來的細胞和載體系統要驗證，常出現包裝細胞、空表達載體質粒就有問題，我們要定期純化生產包裝細胞、空表達載體質粒），細胞培養時讓它“白白胖胖、活力充沛”，目的基因的表達載體構建純化良好，質粒間比例得當，病毒包裝實驗還是能有較好的結果。

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