銳賽小課堂技術篇0702-113 
摘要:

腺相關病毒(AAV)是一種人細小病毒， 因為能作為一種基因治療載體而受到廣泛關注。目前大多數生成rAAV的實驗方案需要共轉染一個載體質粒和一個表達病毒復制和結構基因的包裝質粒到腺病毒(Ad)感染的培養細胞中。但是也可以通過新的輔助質粒(pH3和pH5)，排除了Ad共轉染的需求。輔助質粒表達AAV的rep和cap基因和Ad E2A、VAI和E4基因。當輔助質粒在沒有Ad感染的情況下共轉染到人293細胞中，rAAV載體產量超過了pAAV/Ad包裝質粒的80倍。另外，有復制能力的AAV在rAAV制備過程中少于0.00125%。該雙質粒轉染系統因其簡便性和高產出而使AAV載體系統能被更廣泛地使用。

1．簡介
腺相關病毒(AAV)是一個常見的人細小病毒，自然缺陷、無包被和無致病原性。AAV復制周期由兩個明顯的階段構成：潛伏期和增殖期。在缺少輔助病毒諸如腺病毒(Berns,1990;Muzyczka,1992;Berns和Giraud,1996)、皰疹病毒、牛痘病毒或者在基因毒條件下(Yakobson等,1989),AAV能復制產生子代病毒顆粒。在缺少輔助病毒的情況下，腺相關病毒整合其基因組到19號染色體的一個特別位點并保持整合直到隨后的輔助病毒將其從潛伏狀態下拯救出來(Kotin等，1990)。AAV的位點特異性的整合能力、其自然缺陷以及其無致病原性使其成為基因治療載體成為可能。AAV基因組是一個線性、單鏈(ssDNA)分子，4680個核苷酸，在每個末端含有一個145個堿基末端重復序列(TR)（Srivastava等,1983）。TR序列折疊成發卡結構作為DNA復制起始和包裝重組AAV基因組為感染性的病毒顆粒所需的唯一已知順式作用元件。
重組腺病毒載體(rAAV)的構建通常涉及rep和cap基因的剔除和將感興趣的轉基因插入TR元件之間。關鍵的Ad輔助基因包括：E1a轉錄激活Ad以及AAV基因，E1b和E4編碼增進mRNA裝運到細胞質的蛋白質，E2a表達一個ssDNA結合蛋白質促進AAV DNA復制，VAI RNA基因生成一個小RNA轉錄物增進AAV capsid mRNA的翻譯。
此繁瑣過程的局限性阻止了rAAV廣泛發展為基因治療的載體。如上所述載體的生成總是導致載體的明顯Ad污染，因此需要熱處理和嚴格的純化方法滅活和去除Ad病毒顆粒污染。盡管載體和包裝質粒之間通常沒有同源序列，但是經常產生野生型樣有復制能力的AAV(rcAAV)(Allen等，1997；Wang等，1998)。已經進行了許多嘗試改進rAAV載體的包裝效率。它們包括：發展表達一些或所有包裝所需的AAV基因的細胞系（Yang等,1994;Clark等,1995;Tamayose等,1996;Inoue和Russell,198），構建Ad輔助質粒能夠用來替代Ad感染(Matsu***a等,1998;Xiao等，1998b)和發展重組Ad攜帶rAAV載體基因組(Gao等,1998)。
我們已經構建了新的輔助質粒，完全不用在rAAV包裝過程中感染Ad。這些質粒含有Ad基因組的VA、E2a和E4基因以及AAV的rep和cap基因。當轉染到含有Ad5E1a和E1b基因的人293細胞中，輔助質粒提供了一個有效的、無Ad污染的包裝系統。我們用此新系統所產生的rAAV滴度與大多pAAV/Ad包裝質粒(Samulski等,1989)相比提高了80倍。另外，Ad再也不能產生，有復制能力的AAV在任何載體制備過程中尚未發現。

2.材料和方法
2.1. 質粒、細胞和病毒
一個rAAV載體質粒，表達人綠色熒光蛋白的pTR-UF5(Peel等,1997)被用到所有包裝實驗中來優化該系統。這個pAVbgal載體質粒含有AAV TR，位于巨細胞病毒(CMV)早期轉錄啟動子和E.coli b半乳糖苷酶基因的兩側。PAAV/Ad質粒被用來作為一個包裝質粒與輔助質粒進行比較(Samulski等，1989)。pCDMrep質粒含有AAVrep基因，受CMV早期啟動子的調控(Yang和Trempe，1993)。
19193bp的輔助質粒，pSH3和pSH5可以通過幾個步驟來構建。一個1.5kb含有VAI和VAII基因的HindIII到SalI的片段(來自Ad5的nt9831-11555)被插入到pGEM3Z的同一位點產生pVA3。將一個5.8kb含有E2a基因的BamHI和EcoRI的片段(來自Ad的nt21563-27331)插入到pVA3的同樣位點中產生pVA3E2a。來自pSub201的4.3kb XbaI片段(AAV2中的nt177-4471)，包含AAV rep和cap基因，隨后被插入到pVAE2aE4的兩個XbaI位點。其中一個pVAE2aE4上的XbaI位點位于E2a和VAI和II基因片段，另外一個位點(在Ad2基因組的nt10580)在VAI基因的上游被發現。兩個版本的輔助質粒(pSH3和pSH5)區別在于4.3kb XbaI插入片段的方向，并在Fig.1B顯示。 pSH3和pSH5輔助質粒保存在E.coli的HB101株中。質粒從500ml的細菌培養物中純化出來，其分為4´125m，每個部分用Qiagen Plasmid Maxi試劑盒的方法處理。 人293(Ad-5轉化胎腎上皮)細胞和Hela細胞在補充有10%胎牛血清和抗體的EMEM中培養。細胞在37°C、5％CO2的單層培養基中培養。對照的包裝實驗感染倍數(m.o.i)為15的Ad5型在無血清培養基中培養1h，隨即進行轉染。Ad通過在Hela細胞上的噬斑形成滴定。 Fig.1. rAAV包裝所用的質粒(A)pTR-UF5含有CMV啟動子(箭頭)所驅動的人gfp基因和HSV－tk啟動子(箭頭)所驅動的neoR基因。整個構建的兩側有AAV TR元件(填充的方塊)。pAVbgal含有E.coli b-半乳糖苷酶基因，受CMV啟動子(箭頭)所控制。轉錄盒兩側是AAV TR元件（填充的方塊）。pAAV/Ad含有AAV rep 和cap基因，兩側是Ad末端重復元件（空方塊）（B）pSH3和pSH5含有Ad E4,E2a和VA RNA基因。兩個質粒也含有AAV rep和cap基因。圖下的數字指的是Ad和AAV基因組中的核苷酸數目。pSH3和pSH5的區別是在AAV DNA序列中的方向。為了清楚，質粒圖譜的其余部分未列。

2.2. rAAV載體產生和滴定 對于小規模的包裝實驗，8´105 293細胞在35mm6孔盤上種植。24小時后，根據生產商的方法用lipofectamin（Life Technologies）一式三份轉染培養物。對于開始的優化實驗，所用的載體對輔助質粒的比例在表1列出。根據載體和輔助質粒的大小，1mg:3mg比例相應于1:1的pTR-UF5對pSH3/5的摩爾比。pAAV/Ad質粒與Ad共感染，3或5mg的pAAV/Ad與1mg的pTR-UF5共感染。pGEM3Z質粒(Promega)被共轉染后保持不同轉染的相同總DNA濃度。對于伴隨Ad感染的轉染，在加入DNA到細胞前病毒被吸附到無血清培養基中細胞單層上1h。轉染后72小時，細胞被刮到2ml培養基中收獲起來。細胞隨后用1ml無菌PBS清洗。PBS清洗液加到細胞懸浮物中，凍融5次后超聲破碎(3,36mm 45s)。提取物在4000´g離心10分鐘去除細胞碎片，裂解液上清含有重組載體vAVgfp，它將被用到隨后的轉導中。在轉導之前，這些轉染的Ad用 56°C熱處理30分鐘。 對于大規模載體包裝，20´1 125px的培養盤，每個含有5´106 293細胞，以及用鈣磷酸鹽沉淀方法(Wigler等,1979)轉染了10mg pAVgal和50mg pSH3。72小時后，收獲培養物，低速離心沉淀細胞，沉淀凍融4次，如前所述超聲破碎。CsCl2加到裂解物中，終濃度為1.41g/ml，用折射指數確定。懸浮物在SW41轉頭上40 000rpm離心48小時。將含有可見載體的條帶從梯度中去除，其密度可通過測量折射指數來確定。CsCl2離心步驟重復，獲得的載體制備后進行透析，更換4次PBS，保存在－80°C。產生的載體vAVgal按下述方法滴定。 為了確定rAAV的滴度，4´104Hela細胞被種植到24孔培養盤中，感染m.o.i為10的Ad，用系列稀釋的轉染細胞裂解液進行轉導。2、3天后，在廣泛細胞病理效應被發現之前用帶有EPI-熒光設備的DIAPHOT-***理光倒置顯微鏡在20倍下觀察。計數產生良好分離的熒光細胞載體的稀釋倍數。因而，每個陽性細胞代表了一個載體轉導單位（T.U.）。為了確定rAAVgal載體的滴度，純化載體的稀釋液被用來感染細胞。細胞用PBS溶解的95％甲醇固定，用X-gal顯色。每個藍染的細胞代表一個載體轉導單位(T.U.)。 載體基因組拷貝數用點印跡雜交分析來確定，如前所述方法測定A260(Fisher et al.,1996)。對于6孔盤的小規模包裝實驗，制備的原始載體用DNase I在37°C處理30分鐘。DNase 在75°C滅活，蛋白質用50mM Tris 1mM EDTA 0.1%SDS 0.5mg/ml蛋白酶K在37°C消化12小時。對于CsCl2純化的載體，使用相同的步驟，但不用DNase步驟。載體DNA煮沸5分鐘，用Bio-Dot裝置(Bio-Rad)加到硝酸纖維素膜上（Schleicher和Schuell）。每個孔用0.5M乙酸胺300ml(pH5.2)洗滌。洗滌印跡按照2.4部分 Southern blot方法處理，載體特異的探針標記，暴露于Kodak X-omat X線膠片(Eastman Kodak)。比較載體雜交信號與已知稀釋濃度印跡到同樣濾膜上的質粒DNA，精確估計基因組拷貝數。用Ambis Image Acquisition and Analysis系統定量雜交濾膜上的放射性和X-線膠片上的光密度。

2.3 蛋白質分析 為了分析AAV Rep和Cap蛋白質表達，按照2.2部分所述進行質粒轉染。轉染后48小時，將培養物刮到冷PBS/Mg(PBS含有5mM MgCl2)，細胞低速離心沉淀收獲。細胞沉淀在冰上用200ml STM-NP緩沖液(25mM蔗糖,10mM Tris-HCl，pH8.0,10mM MgCl2,0.5%NP-40,1.0mM PMSF, 0.1Mm DTT)中裂解。裂解物2000´g離心5分鐘獲得核沉淀。核沉淀在200ml IPP緩沖液中重懸，冰浴45分鐘并經常渦旋。核抽提物在14 000´g離心去除DNA和核碎片。上清液與SDS-PAGE樣品緩沖液混合，100°C加熱5分鐘，14mA 10%SDS-PAGE凝膠分離過夜。用一個Trans-Blet SD 半干轉移槽(Bi－Rad)轉移蛋白質到硝酸纖維素膜上。濾膜在PBS溶解的2％奶粉阻斷1-2h，隨后用兔抗Rep（Trempe等，1987）或倉鼠抗Cap（American Type Culture Collection）一抗(含有1%奶粉的PBS稀釋200倍)室溫孵育2小時或4°C過夜。印跡用含有0.05% Tween-20的PBS洗滌3次，每次10分鐘。合適的堿性磷酸酶綴合的二抗用含有1％奶粉的PBS稀釋2000倍，室溫下孵育孵育印跡1小時。用PBS-Tween-20緩沖液洗滌3次，印跡用溶解在二甲基甲酰胺的NBT和BCIP染色5－20分鐘。
2.4 DNA分析 為了分析病毒DNA，包裝轉染按照2.2部分所述進行。轉染后48小時，將培養物刮到冷PBS/Mg，低速離心收獲。染色體外DNA用Hirt的方法(Hirt,1967)從細胞外分離。簡單地說細胞沉淀在200ml裂解液(10mM Tris,pH8.0,1.0mM EDTA, 1.0%SDS)中重懸，加熱40mg蛋白質酶K。37°C消化2個小時后，加入50ml 50M NaCl,冰浴4h。溶液在4°C 14000´g離心30分鐘去除染色體沉淀。上清液用5ml RNase混合液(Ambion, 5mg RNase A,100單位RNaseT1)37°C處理2小時，用酚/氯仿(1:1)抽提1次，再用氯仿抽提1次。DNA用2倍體積的乙醇沉淀，用DpnI處理去除輸入的質粒DNA。DNA在瓊脂糖凝膠 上分離，按上述方法轉移到硝酸纖維素膜上(Hirt,1967)，用Stratalinker (Stratagene)將其UV交粘到濾膜上。濾膜用gfp基因特異的32P探針 或者AAV特異的探針雜交。如前所述進行雜交和洗滌。用隨機標記試劑盒制備雜交探針。膜暴露于X線膠片。 為了估計rcAAV的量，1´106 293細胞感染了Ad（m.o.i）和CsCl2純化的野生型AAV或vAVgal的稀釋液。用pAAV/Ad或pSH3/5作為輔助質粒轉染制備的vAVgfp原液被用來轉導Ad感染的細胞。48小時后，培養物被收獲，病毒DNA被制備并通過瓊脂糖凝膠電泳和Southern 雜交分析。

3.結果
3.1 用AAV/Ad輔助質粒的rAAV包裝 制備重組AAV載體的最常用的實驗方案包括用含有目的基因、病毒TR元件的AAV為基礎的載體質粒和提供Rep和Cap蛋白質的輔助質粒共轉染Ad感染的組織培養細胞。一個最常用的輔助質粒是pAAV/Ad(Samulski 等,1989)。這個方法的主要缺點是在載體原液中污染Ad、生成能夠復制的AAV，而且整個過程的低效率。為了克服這些問題，我們構建了一個新型的含有AAV rep和cap基因以及Ad E2a,E4和VA的輔助質粒。當質粒與高度易轉染的293細胞系聯合使用(Graham等,1977)時，它含有Ad E1a和E1b基因，所有包裝rAAV載體所需要的成分都存在。為了測試這些質粒是否能夠包裝一個AAV為基礎的載體，我們用表達綠色熒光蛋白的pTR-UF5（Peel等，1997）質粒和輔助質粒共轉染到293細胞中(Fig1A)，用的是lipofectamine的方法。為了確定兩個質粒的最佳比例我們使用了幾個不同比例。作為對照，我們同樣使用了Ad-5(15m.o.i)感染293細胞，然后用載體質粒和pAAV/Ad作為輔助質粒轉染它們。72小時后，按2.2部分的方法收獲細胞、裂解準備轉導。裂解液一式三份被用來轉導Ad感染的Hela細胞。綠色熒光細胞3天后用熒光顯微鏡計數。幾個實驗的結果在Table1.列出。很明顯在這些包裝效率與pAAV/Ad輔助質粒相比較的實驗中，我們用pSH3和pSH5質粒獲得了更多的rAAV。我們用輔助質粒常規地比pAAV/Ad和Ad感染獲得更多的rAAV。每個細胞的最高產出135T.U.比pAAV/Ad對照所獲得的高80倍。在其它載體質粒比輔助質粒更多的比例沒有產生大量的rAAV。隨后用點印跡雜交確定的基因組拷貝數目揭示了顆粒－感染比率對于表達gfp的載體在Ad感染的Hela細胞中大約是100。這樣這些實驗獲得的最高得率大約是每個細胞1.36´104 DNase抗性基因組。這些實驗表明了pSH3和pSH5質粒完全支持無Ad共轉染情況下高效率的rAAV包裝。

3.2. Rep和Cap蛋白質表達 為了表明輔助質粒能表達AAV蛋白質，293細胞共轉染了TR-UF5和不同的輔助質粒，如2.2部分所述。將這些培養物轉染48小時后收獲、裂解并用SDS-PAGE和免疫印跡分析。用Rep特異性抗體分析Rep蛋白質的表達(Fig.2A)發現pAAV/Ad(4和5道)的表達顯著低于pSH3(6和7道)或pSH5（8和9道）(1:3或1:5比例使用)的蛋白質水平。在Fig.2A中，我們只指出Rep78和Rep52的位置，因為Rep68與一個交叉反應蛋白質共遷移(在Rep78下可以看到)而Rep40的水平太低不能在核提取物中檢測到。用Cap特異性的抗體分析Cap表達(Fig.2表明當使用pSH3和pSH5輔助質粒與pAAV/Ad相比Cap表達顯著增高。正如所預料的，在pTR-UF5（第2道）和pCDMRep（第3道）轉染的培養物中沒有capsid表達。更高水平的Cap蛋白質可以解釋為pSH3和pSH5產生的rAAV的產率顯著高于pAAV/Ad的。其它表明Cap表達水平對于rAAV的產率是有限的(Vincent等,1997;Li等,1997)。盡管來自pSH3和pSH5的Rep78水平顯著高于來自pAAV/Ad，但我們沒有發現載體產率的減小。Rep78的過表達表明對rAAV的產出有限制(Li等，1997；Vincent等,1997)。另外，在pSH3和pSH5的AAV蛋白質表達方面沒有顯著差別。

3.3.病毒DNA分析 為了分析這些新包裝質粒所產生載體的量和類型，我們共轉染了pTR-UF5質粒和不同的輔助質粒，如2.2部分所述。轉染48小時后，收獲細胞，分離染色體外DNA。低分子量的DNA被DpnI(降解未復制的質粒DNA)消化。消化后的DNA用瓊脂糖凝膠電泳和gfp特異的探針(Fig.3A)或AAV特異的探針(Fig.3進行Southern雜交。在所有含有Rep蛋白質的DNA樣品中都發現存在AAVRFM和RFD (Fig.3A: 2－8道)。復制的載體DNA水平在pAAV/Ad（Fig.3A，3和4道）pSH3或pSH5（Fig.3A，pSH3 5和6道，pSH4 7和8道）被用作輔助質粒時幾乎是相同的。一個相似的膜被探針探測找有復制能力AAV，當使用的是pAAV/Ad時(Fig.3B，3和4道)發現了復制的DNA，但pSH3和pSH5被用作輔助質粒時卻沒有發現(Fig.3B，5和6道)。這些結果表明pSH3/5輔助質粒完全支持AAV載體DNA復制，但是與pAAV/Ad輔助質粒相比產生的rcAAV較少。 3.4. 有復制能力AAV的分析 盡管pAAV/Ad和pTR-UF5之間沒有顯著的同源性，有復制能力的AAV能夠通過載體質粒和pAAV/Ad中rep和cap基因兩側的Ad末端之間的重組生成(Allen等,1997;Wang等,1998)。為了評估從輔助和載體質粒共轉染生成的rcAAV的水平，Ad感染的293細胞感染了不斷增加的m.o.i的野生型AAV或rAAV-gfp載體。轉導2天后，分離低分子量病毒DNA，用放射標記AAV探針Southern雜交分析。當106 293細胞被感染了m.o.i為10-3（大約104基因組）野生型病毒時， AAV DNA被發現(Fig.4, 2道)。當細胞轉導以用pAAV/Ad包裝質粒制備的rAAV-gfp時，復制能力的AAV也被發現(Fig.4, 7道)。在Ad感染的細胞傳代一次后，來自一個pAAV/Ad包裝實驗的rcAAV數量在104和105顆粒之間(由基因組拷貝數目所確定)。然而，在4個不同小規模rAAV-gfp制備中沒發現有復制能力的AAV(Fig.4，8-11道)。利用相同的分析方式，從20´375px培養皿大規模制備rAAV b-gal載體時也沒有能夠發現rcAAV(Fig4 12－17道)。從這些凝膠中最大量的gfp載體(8.0´108顆粒)和最低量的野生型AAV（104顆粒）的分析，我們估計rcAAV污染的量小于每8.0´104載體顆粒一個基因組或載體濃度的0.00125%。隨后的小和大規模載體制備實驗中，Ad感染的293細胞中2次傳代后分析了rcAAV污染，結果沒有檢查到污染。

4．討論

從AAV 獲得的基因治療載體正被廣泛應用于各種獲得性疾病和遺傳疾病。AAV載體的增殖被生成載體所需的耗費體力的方法所阻礙。這里，我們描述了一種新型輔助質粒的構建和分析，它允許無Ad載體的生成，并顯著增加了重組載體的得率。輔助質粒含有Ad的E4、E2a和VA RNA基因以及AAV rep和cap基因。當導入到Ad E1a/E1b轉化的293細胞后，所有所需的Ad輔助基因都提供了，使有效的載體擴增和包裝能夠進行。相似的方法已經有報道，Ad的輔助基因由質粒轉染而不是病毒感染所提供(Grimm等,1998;Matsu***a等,1998;Xiao等,1998b)。完全沒有Ad的污染，且簡化了載體的純化。Grimm等(1998)描述了一個類似我們的Ad輔助質粒的構建并用于包裝的步驟。 用這種新輔助質粒獲得了載體得率的增加。我們已經獲得了超過每個轉染細胞100個gfp表達載體的轉導單位。點雜交分析揭示這與每個細胞超過104載體基因組的得率相對應。我們認為從pAAV/Ad質粒改進的pSH3/5輔助質粒的載體包裝系統是由于(1)更高水平的AAV蛋白質表達(Fig.2)和(2)只導入2個試劑(載體和輔助質粒)到培養細胞中而不是3個試劑(Ad感染，載體和輔助質粒)。我們的新質粒比pAAV/Ad表達更多的Cap蛋白質，它可能完全解釋載體產量的增加。據報道，高水平的Rep78表達會抑制載體的生成(Li等，1997；Vincent等，1997)。然而實驗中來自pSH3/5的Rep78積聚水平比來自pAAV/Ad 的高，但來自pSH3/5的載體產出卻更高。很明顯，來自pSH3/5增加的Cap表達足以克服Rep78的抑制。早期AAV的研究估計每個感染的細胞能產生105-106基因組和104-105組織培養感染單位(Parks等,1967；Rose和Koczot，1972)。因此具有有進一步改進此載體系統的潛力。一個可能增加載體產出的修飾是用ACG替代ATG啟動密碼子以減少Rep的表達，它可以有效地增加載體產出(Li等，1997)。 另外一個AAV包裝系統困擾載體生成的局限性是rcAAV的生成。盡管在大多AAV載體和輔助質粒之間不存在大范圍 (>8bp)的同源性，rcAAV仍然因為非同源性重組而產生(Allen等，1997;Wang等,1998)。我們的輔助質粒含有與野生型病毒相同的AAV的cap和rep基因。因而，有可能由于非同源性重組產生rcAAV。然而，對我們的小規模和大規模制備進行的分析都沒有發現任何rcAAV。Fig.4所示的實驗是在Ad感染的Hela細胞后傳代1次獲得的結果。隨后，實驗制備的載體在Ad感染的細胞中傳2次代未發現rcAAV。沒有rcAAV是這個系統的顯著優勢，因為rep基因表達的病毒能夠影響體內的轉導結果(Halbert等,1997)。 我們研制的輔助質粒包括了一些以前發表的包裝系統的改進。我們剔除了Ad的顛倒末端重復序列，它在pAAV/Ad輔助質粒包裝AAV載體時表明產生了rcAAV(Wang等,1998)。通過將AAV rep和cap基因組裝到一個也含有Ad輔助基因的質粒上，我們無需象其它系統一樣(Matsu***a等,1998；Xiao等,1998b；Grimm等，1998)需要一個3個質粒的轉染系統。Grimm等(1998)研制了一個類似的系統在同一質粒上攜帶AAV和Ad早期基因，并產生了相似水平的載體。總之，我們開發了一個改進的質粒轉染系統來生成重組AAV載體。載體生成的簡捷、載體得率的提高以及沒有rcAAV 或Ad污染使得這個系統對于臨床前期篩選多載體構建特別有用。

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