為什么研究snoRNAs?

引言
核仁小RNA(snoRNAs)是一類中等長度的非編碼小RNA,它們的長度在60-300nt不等，能與核仁核糖核蛋白結合形成snoRNPs 復合物[1]。在脊椎動物中編碼核仁小RNA的基因主要存在于蛋白編碼基因或非蛋白編碼基因的內含子區域，并且經過進一步的轉錄后加工處理形成成熟的核仁小RNA[2]。snoRNAs參與的生物學過程主要有rRNA的加工處理，RNA剪接和翻譯過程的調控以及氧化應激反應[3]。近期的研究表明snoRNAs還參與到遺傳性疾病[4]、人類的變異[5]、造血[6]、代謝[7, 8]以及癌癥[3, 9]的過程中。

snoRNAs的生物合成
snoRNAs主要包含兩個家族：C/D box snoRNAs 與H/ACA box snoRNAs (Fig.1A and Fig.1B)。大多數snoRNAs主要位于由RNA聚合酶II轉錄的基因的內含子區域（Fig.1C）[9]。但snoRNAs也可以來源于長鏈非編碼RNA（lncRNA）的內含子區域。例如GAS5 編碼9個不同的C/D box snoRNAs（snoRNDs74-81）[10]。從內含子上脫離后，pre-snoRNAs進一步的被核酸外切酶處理去除兩端的多余序列，進而形成成熟的snoRNAs.。snoRNAs內部的信號序列指導snoRNAs與相應蛋白結合形成snoRNP復合物來避免被酶切，進而發揮功能。
  

Fig1: The structure and biogenesis of snoRNAs. A. The 2′-O-methylated nucleotides located five nucleotides upstream of the D or D’ box sequences are indicated as red. B. Positions and consensus sequences of the conserved C, C’ box (UGAUGA), and D, D’ boxes (CUGA). The uridine residues selected for pseudouridylation are shown as. C. Biogenesis of snoRNAs ：The great majority of mammalian box C/D and H/ACA snoRNAs are processed from pre-mRNA introns. snoRNAs families are not independently transcribed but processed from the pre-mRNA introns, in most cases by exonucleolytic digestion of the debranched lariat. Box C/D snoRNAs contain four evolutionarily conserved, essential proteins, fibrillarin (methyltransferase), Nop56, Nop58, and 15.5kDa. Proteins common to H/ACA snoRNAs include dyskerin (pseudouridine synthase), Gar1, Nhp2, and Nop10p[9].

snoRNAs的功能

snoRNAs在核糖體RNA加工過程的作用

在核糖體RNA的加工過程中，snoRNAs發揮這兩個基本的作用：核糖體RNA的2′ -O –甲基化和假尿嘧啶化[11]。核糖體RNA的2′ -O –甲基化由C/D box snoRNAs來負責。 C/D box snoRNAs 包含有兩個短的序列元件，即位于5 " 末端的box C(RUGAUGA  R代表A或G)和3" 末端的box D(CUGA)。多數box C/ D snoRNAs基因的5" 和3" 末端都有4 － 5 nt 的反向重復序列，可以形成較為穩定的短莖結構，這一結構在snoRNAs的生物合成和核仁定位過程中起關鍵作用(Fig. 1A)[12]。大部分C/D box snoRNAs的中部，還具有類似于box C 和box D 的結構，通常分別表現出 1 － 2 nt的差異，被稱為box C" 和box D"[13]。核糖體RNA的假尿嘧啶修飾主要是由H/ACA box snoRNAs來完成的。H/ACA box snoRNAs 具有保守的“發夾- 鉸鏈- 發夾- 尾(hairpin-hinge hairpin -tail ) ”的二級結構( Fig.1B)[13] 。box H (ANANNA，N 代表任一核苷酸)位于單鏈形式的鉸鏈區，ACA 則一般位于3" 末端上游3個核苷酸處。H/ACA box snoRNAs的指導序列位于單個或者兩個發夾內部的“假尿嘧啶化泡”(pseudouridylation pocket) 內，它們可以與靶RNA上的被修飾位點兩翼序列各形成4 － 8nt 的互補配對。另外還有一種比較特殊的snoRNAs- SCARNAs，只特異存在于Cajal小體中，能夠對剪接體RNA進行2′ -O –甲基化和假尿嘧啶化修飾[14]。

snoRNAs作為miRNA前體
越來越多的實驗結果表明snoRNAs可以進一步被加工形成更短片段的RNA，并且這些短片段的snoRNAs具有類似miRNA的功能，這就表明snoRNAs可能作為miRNA的前體[15]。ACA45是第一個被報道能夠被降解成短片段的snoRNAs，它是通過與Ago蛋白的相互作用被發現的，而Ago作為miRNA RISC復合物的成員，這就表明ACA45的進一步的加工處理是依賴于Dicer酶的。進一步的實驗表明，降解產生的20-22nt的短片段RNA的作用機制類似與miRNA-抑制目的基因(CDC2L6)的表達[15]。近期報道發現11個C/D box snoRNAs能夠降解形成短片段RNA從而抑制靶基因的表達[16]。

snoRNAs在可變剪切過程中的作用
snoRNAs既能作為miRNA的前體也可以調節RNA的可變性剪切。研究報道HBII-52 C/D box snoRNAs上的18個核苷酸能夠與5-羥色胺受體5-HT (2C)的mRNA序列互補配對進而通過影響5-羥色胺受體5-HT (2C)的可變剪切來調控5-羥色胺受體的表達，最終導致Prader-Willi綜合征[17]。

snoRNAs在應急反應過程中的作用
核仁是細胞應對應急反應的主要參與者。不同的壓力條件能夠導致核仁的變化甚至破壞它。據報道，snoRNAs有助于細胞應對應急反應。在缺氧條件下，SNORD14A 和SNORD83B的表達水平得到顯著提高[18]。另有報道發現，棕櫚酸酯處理能夠導致細胞中SNORDs 32A, 33, 和35A的表達水平也顯著提高。細胞對棕櫚酸酯產生抗性是由于抑制了SNORDs 32A, 33, 和35A的表達，它們介導了由誘導劑引起的細胞死亡[7]。只有在細胞應急反應的早期過程中能夠在細胞質中檢測到snoRNAs的存在。例如，在代謝壓力的早期過程中，相互獨立的snoRNAs(SNORD3, SNORD13和 SNORD118)以及它們各自的靶向mRNA在細胞質中相互依存并且調節它們的翻譯。snoRNAs參與調節的細胞過程將會更加復雜。
  

Fig2: snoRNAs參與的細胞過程[19]

snoRNAs在癌癥中的作用

snoRNAs參與的癌癥的分子病理學

研究snoRNAs在癌癥中的作用起始于一項研究：在腦膜瘤中，與正常腦組織相比snoRNAs的表達大幅下調[20]。最近研究發現，在非小細胞肺癌中多種snoRNAs呈現出不同的表達狀態[21]。其它的研究證明snoRNAs U50 2bp純合缺失突變與前列腺癌的發生發展有關[22]并且在乳腺癌中U50具有雜合缺失以及轉錄下調的特點[23]。另有研究發現snoRNAs以及lncRNA的hostgene-GAS5能夠調控細胞的生存通過誘導或者感受細胞的凋亡。GAS-5在乳腺癌中大幅下調的暗示其可能作為抑癌基因存在[24]。snoRNAs與腫瘤的關系也能夠延伸到與它們相互作用的蛋白分子上。根據它們結構與功能的不同，snoRNP復合物能夠分為兩類C/D box snoRNP和H/ACA box snoRNP。C/D box snoRNP 包含四種進化上保守的，必需的蛋白質，即纖維蛋白 (fibrillarin)/Nop1p、Nop56、Nop58/Nop5p和p15.5KD/ Snu13p，而H/ACA box snoRNP 的結合蛋白包括進化保守的Cbf5p(dyskerin)、Gar1p、Nhp2p 和Nop10p。fibrillarin是發育必須的，缺失fibrillarin能夠導致胚胎致死。Dyskerin、NOP10以及Nhp2p的突變與上皮癌有關[25]。snoRNAs以及snoRNP很可能是通過影響核糖體和蛋白的翻譯來影響腫瘤的發生的，因為在癌細胞中翻譯過程總是異常的。但是snoRNAs也可能通過降解的短片段RNA來發揮miRNA功能進而調節基因的表達來影響腫瘤的發生。孤兒snoRNAs(目前還沒有明確的靶基因)可能成為以后研究的熱點。

snoRNAs作為癌癥診斷和預后生物標志物

snoRNAs在細胞中的功能是多樣的，腫瘤特異表達的snoRNAs可能作為癌癥相關的生物標志物。研究報道snoRNAs能夠在外周血漿以及血清中穩定存在且可測，這使snoRNAs作為潛在的循環腫瘤生物標志物成為可能（table1）[9]。在非小細胞肺癌中 SNORD33, SNORD66和SNORD76不僅在腫瘤中高表達并且在血漿中也檢測到高表達，這使辨別非小細胞肺癌患者成為可能[21]。SNORA42雖在組織相關疾病的預后檢測效果較差，但可以預測疾病[26]。近期的研究成果進一步表明snoRNAs作為生物標志物的巨大應用前途。他們發現SNORD43, SNORD44和SNORD48作為乳腺癌和頭頸部鱗狀細胞癌潛在的抑制劑[27]。U50能夠抑制乳腺癌和前列腺癌（table1）[22, 23]。SNORD113-1在原發性肝細胞癌中表達下調并且在原發性肝細胞癌中作為抑癌基因發揮功能[28]。總之，snoRNAs可以作為癌癥診斷和預后的潛在的生物標志物。

snoRNAs作為癌癥治療的潛在靶點

雖然snoRNAs在腫瘤中發揮功能的分子機制仍然不是很清楚，但其仍是作為基因干預治療的潛在理想對象。由snoRNAs介導的基因沉默可能是最好的治療手段。當然用RNAi介導的基因沉默來選擇性的沉默相關致癌snoRNAs也是不錯的方法。例如，snoRA42在肺癌中是高表達的，在肺癌細胞中選擇性的沉默snoRNAs42，細胞的增殖能力和活力明顯下降[26]。這些實驗證據都表明snoRNAs可以作為癌癥治療的潛在靶點。

snoRNAs和其它疾病

snoRNAs與神經退行性疾病的關系也有報道[29, 30]。一系列獨立的研究表明Prader Willi綜合癥是由于缺失來源于15號染色體15q11–q13區域所致，而此區域則包含兩個snoRNAs家族成員：SNORD115 (HBII-52) 和SNORD116 (HBII-85)[31]。SNORD115可能影響大腦中5-HT2CR的mRNA水平[17]。SNORD116的缺失是導致Prader Willi綜合癥發病的主要原因。最近的一項研究表明，C/D box snoRNAs 表達水平的變化也發生在孕婦酒精消耗引起的異常胎兒大腦發育的過程中。特別注意的是在此過程中SNORD115表達上調，SNORD116表達下調[32]。SNORD115表達水平的變化導致了各種心理和行為畸變典型自閉癥[33]。同時另外一項研究報道在病毒感染的細胞中一系列snoRNAs的表達水平在病毒感染后得到明顯上調[34]。一方面snoRNAs可以作為受體抗病毒反應的調節者；另一方面，調控RNA的活性可以被病毒利用使其逃避天然免疫從而完成其生命周期[35]。

總結

在人類細胞中的，RNA的轉錄后修飾、mRNA的穩定性和翻譯的控制是基因表達調控的重要組成部分。snoRNAs和它們產生的功能短片段RNA在這些過程中發揮著重要作用:它們指導核糖體RNA（rRNA）和核小RNA(snRNA)的修飾、影響其互補前體mRNA的剪接以及控制mRNA的翻譯和穩定性。外界因素以及細胞內部的信號級聯反應能夠導致snoRNAs表達水平的變化，進而引起細胞水平的生理變化、器官功能障礙以及各種疾病。snoRNAs的結構，表達模式和在細胞中的定位具有重要的調控作用，被認為是病理診斷的標志物。snoRNAs表達水平和功能機制的研究將為人類疾病的診斷和治療提供新的希望。

參考文獻
1. Esteller, M., Non-coding RNAs in human disease. Nat Rev Genet, 2011. 12(12): p. 861-74.
2. Kiss, T., et al., Biogenesis and intranuclear trafficking of human box C/D and H/ACA RNPs. Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 2006. 71: p. 407-17.
3. Williams, G.T. and F. Farzaneh, Are snoRNAss and snoRNAs host genes new players in cancer? Nat Rev Cancer, 2012. 12(2): p. 84-8.
4. Sahoo, T., et al., Prader-Willi phenotype caused by paternal deficiency for the HBII-85 C/D box small nucleolar RNA cluster. Nat Genet, 2008. 40(6): p. 719-21.
5. Bhartiya, D., et al., Systematic curation and analysis of genomic variations and their potential functional consequences in snoRNAs loci. Hum Mutat, 2012. 33(10): p. E2367-74.
6. Bellodi, C., et al., H/ACA small RNA dysfunctions in disease reveal key roles for noncoding RNA modifications in hematopoietic stem cell differentiation. Cell Rep, 2013. 3(5): p. 1493-502.
7. Michel, C.I., et al., Small nucleolar RNAs U32a, U33, and U35a are critical mediators of metabolic stress. Cell Metab, 2011. 14(1): p. 33-44.
8. Youssef, O.A., et al., Potential role for snoRNAss in PKR activation during metabolic stress. Proc Natl Acad Sci U S A, 2015. 112(16): p. 5023-8.
9. Mannoor, K., J. Liao, and F. Jiang, Small nucleolar RNAs in cancer. Biochim Biophys Acta, 2012. 1826(1): p. 121-8.
10. Smith, C.M. and J.A. Steitz, Classification of gas5 as a multi-small-nucleolar-RNA (snoRNAs) host gene and a member of the 5'-terminal oligopyrimidine gene family reveals common features of snoRNAs host genes. Mol Cell Biol, 1998. 18(12): p. 6897-909.
11. Panse, V.G. and A.W. Johnson, Maturation of eukaryotic ribosomes: acquisition of functionality. Trends Biochem Sci, 2010. 35(5): p. 260-6.
12. Thorenoor, N. and O. Slaby, Small nucleolar RNAs functioning and potential roles in cancer. Tumour Biol, 2015. 36(1): p. 41-53.
13. Kiss, T., Small nucleolar RNA-guided post-transcriptional modification of cellular RNAs. EMBO J, 2001. 20(14): p. 3617-22.
14. Ganot, P., M.L. Bortolin, and T. Kiss, Site-specific pseudouridine formation in preribosomal RNA is guided by small nucleolar RNAs. Cell, 1997. 89(5): p. 799-809.
15. Ender, C., et al., A human snoRNAs with microRNA-like functions. Mol Cell, 2008. 32(4): p. 519-28.
16. Brameier, M., et al., Human C/D box snoRNAss with miRNA like functions: expanding the range of regulatory RNAs. Nucleic Acids Res, 2011. 39(2): p. 675-86.
17. Kishore, S. and S. Stamm, The snoRNAs HBII-52 regulates alternative splicing of the serotonin receptor 2C. Science, 2006. 311(5758): p. 230-2.
18. Liu, Z.H., et al., Small ncRNA expression and regulation under hypoxia in neural progenitor cells. Cell Mol Neurobiol, 2011. 31(1): p. 1-5.
19. Makarova, J.A., et al., New functions of small nucleolar RNAs. Biochemistry (Mosc), 2013. 78(6): p. 638-50.
20. Chang, L.S., et al., Differential expression of human 5S snoRNAs genes. Biochem Biophys Res Commun, 2002. 299(2): p. 196-200.
21. Liao, J., et al., Small nucleolar RNA signatures as biomarkers for non-small-cell lung cancer. Mol Cancer, 2010. 9: p. 198.
22. Dong, X.Y., et al., Implication of snoRNAs U50 in human breast cancer. J Genet Genomics, 2009. 36(8): p. 447-54.
23. Dong, X.Y., et al., SnoRNAs U50 is a candidate tumor-suppressor gene at 6q14.3 with a mutation associated with clinically significant prostate cancer. Hum Mol Genet, 2008. 17(7): p. 1031-42.
24. Mourtada-Maarabouni, M., et al., Growth arrest in human T-cells is controlled by the non-coding RNA growth-arrest-specific transcript 5 (GAS5). J Cell Sci, 2008. 121(Pt 7): p. 939-46.
25. Gupta, V. and A. Kumar, Dyskeratosis congenita. Adv Exp Med Biol, 2010. 685: p. 215-9.
26. Mei, Y.P., et al., Small nucleolar RNA 42 acts as an oncogene in lung tumorigenesis. Oncogene, 2012. 31(22): p. 2794-804.
27. Gee, H.E., et al., The small-nucleolar RNAs commonly used for microRNA normalisation correlate with tumour pathology and prognosis. Br J Cancer, 2011. 104(7): p. 1168-77.
28. Xu, G., et al., Small nucleolar RNA 113-1 suppresses tumorigenesis in hepatocellular carcinoma. Mol Cancer, 2014. 13: p. 216.
29. Doe, C.M., et al., Loss of the imprinted snoRNAs mbii-52 leads to increased 5htr2c pre-RNA editing and altered 5HT2CR-mediated behaviour. Hum Mol Genet, 2009. 18(12): p. 2140-8.
30. Sridhar, P., H.H. Gan, and T. Schlick, A computational screen for C/D box snoRNAss in the human genomic region associated with Prader-Willi and Angelman syndromes. J Biomed Sci, 2008. 15(6): p. 697-705.
31. Cavaille, J., et al., Identification of brain-specific and imprinted small nucleolar RNA genes exhibiting an unusual genomic organization. Proc Natl Acad Sci U S A, 2000. 97(26): p. 14311-6.
32. Laufer, B.I., et al., Long-lasting alterations to DNA methylation and ncRNAs could underlie the effects of fetal alcohol exposure in mice. Dis Model Mech, 2013. 6(4): p. 977-92.
33. Nakatani, J., et al., Abnormal behavior in a chromosome-engineered mouse model for human 15q11-13 duplication seen in autism. Cell, 2009. 137(7): p. 1235-46.
34. Saxena, T., et al., Combined miRNA and mRNA signature identifies key molecular players and pathways involved in chikungunya virus infection in human cells. PLoS One, 2013. 8(11): p. e79886.
35. Cullen, B.R., MicroRNAs as mediators of viral evasion of the immune system. Nat Immunol, 2013. 14(3): p. 205-10.