2017年國自然申請的熱點什么？circRNA，lncRNA，外泌體。除了這些大家耳熟能詳的香饃饃之外，現在很多小伙伴們開始了新的玩法，通過多平臺聯用，將不同層面的東西結合起來，比如，表觀遺傳與非編碼RNA的結合，就是一個很好的例證。

研究背景

肺癌是一種常見的惡性腫瘤，特別在中國，由于環境的污染，肺癌的發生率也在持續升高。非小細胞肺癌（NSCLC）是肺癌中最常見的一種，大約占了肺癌總量的85%，但是，目前我們對于NSCLC的理解還是處于初級階段。其中，表觀遺傳學和轉錄組學的研究為我們理解腫瘤的發生提供了很多的證據。那么，這兩個層面的分子又存在什么樣的關聯呢？本研究從甲基化，lncRNA和基因表達調控的角度出發，為我們理解NSCLC的發生和臨床診斷提供了新的靶標。

研究思路

研究結果

1． 鑒定NSCLC特異性lncRNA-mRNA

NSCLC在轉錄組層面，有哪些特異性表達的分子呢？利用轉錄組表達譜芯片（SBC human lncRNA array伯豪生物提供），研究人員發現有8500個lncRNA和1685個mRNA在癌和癌旁中有顯著差異。通過對這些差異基因分析相關性，發現有1345個lncRNA與mRNA存在cis關系，159個lncRNA與mRNA有trans關系。把這些與lncRNA關聯的cis mRNA進行IPA功能（IPA分析，詳情咨詢shbio）分析發現，主要的pathway涉及到腫瘤相關，包括細胞死亡與生存，細胞發育，細胞生長和增殖，表明這些關聯的lncRNA可能參與腫瘤發生過程。研究人員把其中的兩個lncRNA與mRNA(LOC146880/KPNA2，ENST00000439577/RCC2)作為后期驗證的重點。

2. lncRNA與甲基化關聯分析

除了轉錄組層面的變化，表觀遺傳層面會有什么差異呢？利用甲基化芯片，研究人員發現癌和癌旁共有113644個差異CpG位點。其中，cg12562461位點正好位于LOC146880的啟動子區，且在癌組織中甲基化程度低。因此，cg12562461的低甲基化正好與LOC146880的高表達相對應。

3.lncRNA/mRNA與臨床指標關聯性分析

通過qPCR，研究人員首先在大量樣本中（402個癌組織，105個癌旁組織）進行了驗證，發現LOC146880和KPNA2在癌中高表達，且兩者表達顯著相關。進一步分析LOC146880和ENST00000439577與病人臨床指標，發現LOC146880與病理類型和腫瘤大小有關，ENST00000439577的表達與轉移狀態和疾病stage有關。Kaplan-Meier 生存曲線分析顯示，training組和validation組中，高的LOC146880伴隨著低的總生存期。同時，在126個癌組織和30個癌旁中，cg12562461的甲基化程度也明顯低于癌旁。同樣，ENST00000439577和RCC2的表達也是在癌組織中高，兩者表達正相關。高的ENST00000439577表達也與低總生存期相關。因此，這兩個lncRNA可以作為潛在的診斷指標。

4.lncRNA細胞系功能驗證

為驗證在肺癌中LOC146880的生物學功能，研究人員分別檢測了三個NSCLC細胞系（A549，PC9，H1299）和正常細胞系，發現LOC146880在A549和PC9中表達高。當在這兩個細胞系中siRNA- LOC146880敲降，發現KPNA2的表達也隨之降低。此外，細胞增殖，遷移和侵襲受到抑制，細胞周期過程減慢了G2/M phase。因此，這些結果都表明LOC146880可能是NSCLC的致癌因子。

基于TRANSFAC預測，研究人員發現LOC146880的CpG位點區有轉錄因子SP1的結合位點。當將LOC146880的啟動子區載體構建（pGL3- LOC146880），和SP1過表達載體同時轉染HEK293T，A549，H1299時，發現pGL3- LOC146880顯著激活。因此，SP1確實能結合到LOC146880啟動子區，通過轉錄調控影響其表達。

在NSCLC三個細胞系（A549，H1975，H1299）和正常細胞系檢測ENST00000439577表達，發現比正常細胞系中都高。當在A549，H1299中siRNA干擾后，RCC2表達也降低，細胞增殖，遷移和侵襲也降低，細胞在G2/M phase稍微降低。因此，ENST00000439577可能也是肺癌的一個致癌因子。

研究結論

該研究通過將表達譜芯片與甲基化芯片結果進行關聯分析，找到了啟動子區甲基化降低，同時基因表達升高的lncRNA，并發現他們的表達與cis靶基因KPNA2和RCC2的表達正相關，并與低生存期相關。細胞系的siRNA干擾，功能實驗驗證表明，這兩個lncRNA抑制了細胞增殖，侵襲和轉移。該研究同時將表觀遺傳和轉錄關聯起來，從更全面的角度去理解了lncRNA在非小細胞肺癌中的作用。這種平臺聯用的方式是該研究的亮點，也是現在最新的流行趨勢，非常值得借鑒。

原文出處：Feng N, Ching T, Wang Y，et al. Analysis of Microarray Data on Gene Expression and Methylation to Identify Long Non-coding RNAsin Non-small Cell Lung Cancer. Sci Rep.2016.