WB檢測之二抗

二抗選擇

  二抗是用一抗免疫動物制備的抗一抗的抗體，選擇范圍較窄，基本是商品化的，在不考慮二抗修飾類型的前提下，二抗的選擇需要遵循以下原則：二抗來源種屬、一抗來源種屬和抗原來源種屬互不相同。例如如果研究對象是人的蛋白X，選擇了鼠抗X一抗，則可選擇兔抗鼠二抗或者羊抗鼠二抗。

二抗選擇要考慮的問題有：

①對單抗類一抗，二抗需與一抗的類別或亞類相匹配（多抗類一抗主要是IgG類免疫球蛋白故相應二抗就是抗IgG抗體，不作考慮）。

②某些組織或細胞含有較多的Fc受體，如脾臟、淋巴細胞等，此時二抗需要選擇抗IgG F(ab’)₂二抗，避免各種Ig保守結構域導致的交叉反應。然而各種Ig仍具有保守的輕鏈結構域，因此還是有一定程度的交叉反應。

WB檢測之內參抗體

  Western Blot檢測方法不僅能檢測靶蛋白存在與否，還能比較不同條件下或者不同組織中靶蛋白的相對表達量，可作為蛋白表達水平最直接的證據。在WB實驗中有眾多不確定因素影響靶蛋白表達水平的測定，如方法學本身性質、操作誤差等。為準確衡量靶蛋白表達水平，需要精確一致的上樣量，使用內參的意義即是保證上樣量的一致。內參即內部參照（Internal Control），對哺乳動物細胞一般指管家基因的表達蛋白(Housekeeping Proteins)。此類蛋白在各組織和細胞中的表達相對恒定，可作為檢測蛋白表達水平變化的參照物。當內參條帶亮度基本一致時，基本可以確定上樣量是一致的，通常采用比較靶蛋白和內參蛋白條帶亮度比值來進行相對定量。

  WB實驗中涉及到的蛋白-抗體結合是一個復雜的活性生物大分子間的相互作用，眾多因素都會影響實驗的結果。例如時間、溫度、濃度、離子強度等，在實驗設計時就需要有嚴謹的對照方案，通過對照就容易判斷問題所在，嚴謹的WB實驗中需要設立蛋白分子量標準、空白載體對照、未誘導對照、已知量標準物正對照和內參。

內參使用方法

1.標記內參：酶標的內參抗體可避免二抗結合總蛋白中某些免疫球蛋白產生的雜帶，使用時只需在二抗孵育時加入酶標內參抗體，按照正常操作即可。

2.普通內參：當靶蛋白分子量與所選內參分子量相差不大時，可先對靶蛋白進行顯色檢測，然后用Strip緩沖液洗掉膜上抗體，重新對內參蛋白進行顯色檢測。當靶蛋白分子量與所選內參分子量相差較明顯時，可對轉膜預染，根據蛋白質分子量將膜剪為兩部分并分開進行靶蛋白和內參蛋白的顯色檢測。

內參抗體選擇

  常用的蛋白內參有GAPDH和β-actin或β-tubulin，內參的選擇原則是選擇與靶蛋白分子量相差5KD以上的內參，對不同的樣本則需要根據實際情況進行選擇。

1.根據物種選擇

  哺乳動物來源的組織或細胞樣本通常選擇β-actin、β-tubulin、GAPDH、Lamin B、Histone H3、Na⁺/K⁺-ATPase等。植物來源的樣本常選擇plant actin、Rubisco等。對于其他研究稀少的物種可參考報導的文獻進行選擇。以GAPDH為例，抗GAPDH單抗（ABGENT，clone 6C5）能夠與非洲蟾蜍、猴、豬、羊、狗、貓、魚、蛙、雞、兔、小鼠、大鼠及人組織來源的GAPDH反應，但不能與酵母GAPDH反應。

2.根據組織類型選擇

  以肌動蛋白actin為例，肌動蛋白actin在不同物種之間高度保守，且同一物種不同類型actin的序列相似性大于90%，使其很難獲得特異性較好的抗actin抗血清。但同一物種不同類型actin的N段序列相似性僅50~60%，故N端序列常被用來制備抗actin的抗體。脊椎動物肌動蛋白分為α、β和γ三種類型，α型分布于心肌、橫紋肌細胞和平滑肌細胞中，γ型分布于平滑肌細胞和非肌細胞中，β型分布于非肌細胞中，共六種actin蛋白。不同廠商生產抗β-actin抗體過程中選擇的免疫區段在不同型actin之間的保守與否影響到抗體的組織特異性。選用β-actin N端的16個氨基酸序列制備的單多抗占大多數，這類抗體均不能檢測心肌和橫紋肌中的actin條帶。選用β-actin C端16個氨基酸序列制備的抗體則可以在肌肉細胞中檢測到actin的信號。

3.根據蛋白組分選擇

  提取細胞蛋白組分過程中，胞漿蛋白通常是最先提取出來的。離心全細胞裂解液所得的上清含胞漿蛋白，而沉淀含胞核蛋白和胞膜蛋白，繼續加大裂解程度即可提取到胞核蛋白，最后才能提取到胞膜蛋白。通過特殊的方法還可以從胞漿蛋白中提取到線粒體蛋白、葉綠體蛋白等。針對不同的細胞組分需要選擇不同的內參抗體。

  在選擇細胞總蛋白內參時，GAPDH、β-actin、tubulin三種內參同時發生變化的情況很少。如出現這種情況，可用胞核內參甚至線粒體內參代替。另外，不同的實驗目的應選擇不同的內參，例如檢驗質核分離效果應選擇胞漿蛋白內參actin，抽提的核組分中檢測不到actin則表示質核分離效果較好。

  總之，內參的選擇要根據實際情況而定，不僅要考慮到物種、組織、組分等因素，還需要考慮到實際的實驗設計。如實驗設計中包括組織缺氧、糖尿病等因素變量，則不適宜選擇GAPDH作內參，研究細胞增殖的相關實驗中則不適宜選擇c-Jun作內參，在凋亡實驗中則要避免使用TBP、Lamin等。