徠卡課堂 | LAS X功能冰山一角之FRET成像

隨著顯微成像技術的發展，科研工作者對成像分辨率的要求越來越高，為此Leica在最新一代SP8共聚焦顯微鏡的基礎上相繼推出了超高分辨的STED和高分辨的Hyvolution；另一方面，簡單的圖像采集和分辨率的提升已經不能滿足很多科研工作者的需求，他們需要更高級更強大的成像功能與圖像處理功能。

LAS X軟件作為Leica顯微成像的搭載平臺，不僅能夠提供完美的成像質量，而且整合了眾多高級應用并具有強大的后期數據處理分析功能，包括圖像2D、3D測量與分析功能、FRAP功能、FRET功能、Hyvolution高分辨功能、活細胞記錄分析功能（live data mode）等，可根據用戶不同的需求提供靈活的成像方案。

接下來小編將以FRET為例介紹其在生物醫藥領域中的應用。

圖1 LAS X軟件強大的圖像后期處理及高級成像模塊。

FRET 簡介

FRET（Förster resonance energy transfer，熒光共振能量轉移）發生在供體熒光分子與受體熒光分子的距離足夠近且供體的發射光譜與受體的吸收光譜相重疊時（10 nm以內）。當供體分子吸收一定頻率的光子后被激發到更高的電子能態，在該電子回到基態前，通過共振實現能量向鄰近受體分子轉移。發生FRET后，供體的熒光強度比它單獨存在時要低的多，而受體發射的熒光卻大大增強，同時供體的熒光壽命也會因FRET的發生而縮短（FLIM-FRET應用）。

因此通過FRET可以分別從熒光強度及熒光壽命兩個維度檢測分子間的相互作用及分子的折疊與構象變化。

圖2 FRET發生原理。

FRET 在生物醫藥領域中的應用

1）2016年發表在nature communication上的文章“AFRET biosensor reveals spatiotemporal activation and functions of aurora kinaseA in living cells”通過FRET技術構建了一種新型的生物敏感器（biosensor），通過該敏感器可以實現在活細胞內對Aurora kinase A蛋白時空調控及功能的研究。

首先，作者分別在體外和體內借助FLIM-FRET及免疫印跡技術證明生物敏感器GFP-AURKA-mCherry能夠正確的反映Aurora kinase A的激活情況，且其發生FRET的條件即其構象的改變是由其Thr288發生磷酸化導致的。通過定位及功能回復實驗，作者進一步證明該生物敏感器能正確行使Aurora kinaseA的功能。

圖3 在體外通過FLIM-FRET技術驗證GFP-AURKA-mCherry生物傳感器。

接下來通過該生物敏感器，作者成功實現了在活細胞內對Aurora kinaseA時空激活調控的觀察，證明其在G1時期被激活，并通過TPX2和CEP192蛋白協同調節微管的穩定性。

圖4 TPX2和CEP192在G1時期激活GFP-AURKA-mCherry。

Aurora kinase A是公認的治療癌癥的藥物作用靶點，由于其表達量低，在活細胞內對其進行跟蹤研究非常困難。該生物敏感器基于FRET技術構建，通過FLIM-FRET技術可成功實現在低表達量的條件下對Aurora kinase A展開研究，因此該生物敏感器對于針對Aurora kinase A的信號通路研究及癌癥藥物篩選具有重要意義。

2）另一篇發表在oncotarget上的文章“HER2-HER3 dimer quantification by FLIM-FRET predicts breast cancer metastaticrelapse independently of HER2 IHC status”利用了FLIM-FRET技術檢測乳腺癌病人中HER2-HER3二聚體的水平。HER2表達水平升高是乳腺癌診斷中的一個重要指標，然而并不能用來檢測僅由HER2-HER3二聚體升高引起的乳腺癌，因此急需新的檢測方法。本文章基于FLIM-FRET技術順利實現了對HER2-HER3二聚體水平的檢測，因而成為檢測由HER2-HER3升高引起的乳腺癌的一個新型診斷方法，對乳腺癌發生及愈后診斷具有重要意義。

圖5 通過FLIM-FRET技術檢測HER2-HER3二聚體水平。

小結

LAS X軟件中提供了專門的FRET技術操作向導，可分別通過FRET-AB（acceptor photo-bleaching）和FRET-SE（sensitizedemission）兩種方法對樣本進行檢測，用戶只需根據操作向導一步步操作就可輕松得到樣本的FRET數據。

圖6 LAS X軟件中的FRET操作向導。

對于其他高級成像模式，如FRAP、Hyvolution等，用戶同樣可根據相應操作向導快速實現數據的采集。結合LAS X強大的圖像后期處理及分析功能，便可輕松獲得可靠的數據。

參考文獻：

1. Giulia Bertolin et.al., A FRET biosensor revealsspatiotemporal activation and functions of aurora kinase A in living cells,Nature Communications, 2016 Sep.

 2. Gregory Weitsman et.al., HER2-HER3dimer quantification by FLIM-FRET predicts breast cancer metastatic relapseindependently of HER2 IHC status, oncotarget, 2016 July.