蛋白分離、雜交、檢測、分析

前瞻回顧

鑒于小編在《Azure Biosystems Western Blotting工作流程之實驗方法的選擇》中和大家聊了Western blot的實驗方法選擇，相信大家已經將您的western blot 實驗方法選擇好了，那么這期小編和大家聊聊western blot的實驗流程中的那些事。

蛋白分離

電泳準備？

玻璃配膠板要清洗干凈，以免引起配膠問題，影響蛋白分離

配膠液要充分混勻，凝聚時間要夠，如膠凝聚不均勻，會造成膠分辨率差。出現笑臉皺眉條帶

電泳時，上樣體積和濃度最好保持一致，這樣可以防止出現條帶過寬或者過窄的情況產生

如何選擇膜？

膜上有蛋白質的結合位點，可結合從凝膠中轉移的蛋白質。常用的膜是硝酸纖維素膜（NC膜）和PVDF膜。

NC膜

低分子量蛋白檢測

通常用于化學發光法

蛋白剝離效果不理想

PVDF膜

低表達蛋白結合能力強

通常用于熒光方法（自發熒光背景低）

剝離和二次雜交時，蛋白的截留能力強

如何建立轉膜系統

常用的轉膜系統形式為 “三明治” 結構，凝膠和膜緊密貼合，放在兩張轉印濾紙之間，用電極板夾夾住，置于轉印buffer中，正負電極通電后，將蛋白質從凝膠轉移到膜上。轉印濾紙 （濾紙） 能夠保持均勻一致的壓力，確保膜和凝膠間沒有空隙，并保持轉移buffer充盈在“三明治”結構中蛋白完全從凝膠轉移至膜上。 

Blot前準備什么？

當優化轉印設置、條件及實驗時，最重要的是確定樣品中所有蛋白是否從膠上完全轉移到膜上。使用SelfStain^TM免染膠來顯示膜上的所有蛋白 ，并立即進行western blot后續步驟。 

膜封閉

封閉目的是防止非特異性結合，降低背景對目的信號的干擾。如使用脫脂奶粉做封閉液，最好將脫脂奶粉進行濾膜過濾，這樣可以減少后期顆粒背景的產生。

一抗孵育

確保新的一抗濃度經過優化。如有確證過的一抗，可嘗試將一抗標記熒光染料，直接進行一步法Western blot檢測。

洗膜和二抗孵育

每次孵育后，洗去多余的抗體對于降低背景信號至關重要。熒光方法Western blot中，洗膜還可以去除有自發熒光的去垢劑。洗膜的時候如果多張，建議分開進行清洗，同時洗膜液體積不能太少。

化學發光檢測

嘗試不同的底物增加靈敏度和信號持久性；化學發光底物使用前需要平衡至室溫，可以增加酶的活性；數字成像系統要靈敏度很高。

熒光檢測

保持所有物品的清潔，確保無背景干擾；印跡膜避光保存；使用背景淬滅板降低背景熒光，增強信噪比。

檢測

Azure Biosystems c系列成像系統

Azure c 系列成像系統提供 4 款性能卓越的 Western blot 成像系統。可以選擇滿足現有實驗需求的型號，當需要提升應用范圍時，通過升級即可完成

分析

AzureSpot分析軟件

AzureSpot 分析軟件作為分析膠和膜的工具，把復雜的分析變得簡單化。

1.在樣品上進行泳道劃分           2.設置閾值，檢測條帶

3.扣除背景，提供有多種背景扣除方法可選4.查看結果，可作出修改或對任意條帶邊界進行編輯

5.使用標準分子量marker來確定樣品的分子量，或者使用標準品來確定濃度