步進式平衡透析，藥物-血漿蛋白體外結合研究
簡介
胰高血糖素樣肽-1可誘導胰島素的葡萄糖依賴性刺激，降低胰高血糖素分泌，可用于2型糖尿病的治療，但其易被二肽基肽酶-4降解，體內半衰期僅為1h。利拉魯肽是胰高血糖素樣肽-1類似物，其交聯到16C脂肪酸殘基，促進可逆的自身締合，并結合至血漿白蛋白，半衰期可延長至13h。
藥物的血漿蛋白結合受諸多因素影響，而該過程對于預測藥物動力學、藥效學及計量-反應關系十分重要，對于延長藥物的作用時間也十分關鍵，所以有必要研究各種因素對結合過程的影響。
超濾是常用的血漿蛋白結合研究方法，適用于不會快速代謝或降解的藥物，但疏水性藥物會吸附到膜表面，影響定量。常規的平衡透析方法也存在該問題。而本實驗使用反復步進式平衡透析方法，定量檢測利拉魯肽的血漿蛋白結合。
實驗
利拉魯肽用放射性同位素標記，以便通過液體閃爍計數方法來定量。利拉魯肽儲液（107 pM）溶于KH緩沖液，然后連續稀釋，獲得105及103 pM溶液。再以血漿10倍稀釋，獲得106、104和102 pM溶液。
實驗使用15mL Nunc Minisorb 離心管為外室，用利拉魯肽緩沖液預包被（37℃ 30min，然后過夜），然后將含有特定濃度利拉魯肽血漿孵育溶液的Spectra/Por 15kD 纖維素酯即用型透析袋放入外室內，37℃攪拌孵育4-5h。孵育結束后，從內室和外室分別取樣檢測。實驗分別測試了利拉魯肽濃度106、104和102 pM，膜內外濃度比100:1和50:1條件下的藥物結合率，并通過測試日內/日間差，評估實驗重現性。實驗同時檢測了利拉魯肽與人血清白蛋白（HAS）及α1-酸性糖蛋白（AAGP）的結合。
平衡透析實驗設置如圖所示，兩個室內均有利拉魯肽，以避免其被透析膜捕獲。實驗在不同跨膜濃度比條件下進行，直到藥物過膜流動極低，說明整個系統已達到平衡。
結果
實驗日內及日間變異系數分別為0.1%和0.11%，說明具有良好重現性。臨床濃度（104pM）利拉魯肽的蛋白結合率可達98-99%，稀釋至102pM不會影響其結合度。HSA是豐度最高的血漿蛋白，而AAGP水平在某些疾病狀態下會急劇升高，實驗顯示104pM利拉魯肽（膜內/外比為100:1）與兩者結合率可達99%。
與大多數血漿蛋白結合藥物一樣，只有未結合的利拉魯肽可與效應器作用，產生藥理反應。分析顯示98-99%的利拉魯肽可結合至血漿蛋白，亦即在臨床相關濃度（104pM）條件下，未結合利拉魯肽的濃度為100-200pM，與利拉魯肽半數最大效應濃度相當。如藥物的血漿蛋白結合程度發生改變，將會影響其容積分布和清除速率。
血漿蛋白水平的降低會影響利拉魯肽的蛋白結合，2型糖尿病常伴發肝或腎損傷，導致HSA水平降低或低蛋白血癥，但實驗顯示，利拉魯肽的藥物動力學狀態不受其影響。
16C脂肪酰化多肽的親脂特性使其很難通過超濾法檢測血漿蛋白結合，因為會被過濾膜“捕獲”。在本實驗中，將利拉魯肽溶于在血漿/蛋白孵育溶液和緩沖孵育溶液中，防止了親脂性分子被透析膜捕獲，此外，對外室進行預包被，防止了藥物因吸附到外室表面導致損失，兩者結合，保證了利拉魯肽血漿蛋白結合的準備測量及實驗的重現性。
反復步進式平衡透析適用于利拉魯肽蛋白結合的體外定量檢測，結果顯示其結合率高約~99%，使其作用期較長的原因。由于血漿蛋白的生理水平相對利拉魯肽較高，所以結合不會受低疾病狀態下的低白蛋白水平影響。該方法將來也可用于檢測其它親脂性藥物分子的血漿蛋白結合效應。
詳細內容，請參考原文：Plum A., Jensen L. B., Kristensen J. B., In Vitro Protein Binding of Liraglutide in Human Plasma Determined by Reiterated Stepwise Equilibrium Dialysis. Journal of Pharmaceutical Science, 2013, 102(8): 2882 – 2888.
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