腺相關病毒（AAV）屬于依賴病毒屬，細小病毒亞科，是一類自然缺陷的單鏈DNA病毒。野生型AAV基因組約4.7kb，含有rep和cap基因以及兩端的ITR序列。盡管人類對AAV易感，但臨床還并未發現與AAV相關的疾病。根據AAV衣殼蛋白基因的變異，可將AAV分為不同的血清型。不同血清型的AAV具有不同的組織特異性。將興趣基因取代rep和cap基因構建一個兩段帶有ITR的載體，并將rep和cap置于一個獨立的載體上，加上帶有腺病毒輔助基因載體，便可包裝出帶有興趣基因的重組腺相關病毒（rAAV）。

目前rAAV已被廣泛作為基因轉導載體使用，rAAV在人體實驗中的安全性也已被證實。早在1996年，科學家們就選擇肺作為rAAV的第一個靶向實驗器官。下面我們旨在介紹rAAV在肺部實驗中的啟動子、血清型的選擇，及其小鼠肺部的AAV注射方法。

• 啟動子的選擇

根據不同的注射方式和實驗目的，可選擇不同的啟動子以提高肺部表達效率。CMV在啟動真核基因表達方面具有極高的效率，可高效感染小鼠肺部；CAG同樣具有出色的感染氣道的能力。

• 血清型的選擇研究表明，針對肺部感染rAAV在血清

研究表明，針對肺部感染rAAV在血清型上的選擇根據動物模型的不同而存在差異，主要體現在小鼠及較低等靈長類動物與高等靈長類動物中之間。

 在小鼠及一些較低等的靈長類動物中，AAV5及AAV6是感染肺部的最佳選擇。

針對高等靈長類動物，AAV1對肺部的感染效率更高；而在肺癌的研究中，我們推薦AAV血清型選擇如下：

• 小鼠肺部AAV注射方法

AAV感染肺部有多種方法，較為常用的方法為鼻內滴注、氣管插管、氣管內注射等。當對肺部感染AAV的特異性要求較低時，也可采用靜脈注射的方法；當進行肺癌成瘤實驗時，也可采用瘤內注射的方式。

在此，我們針對鼻內滴注、內鏡輔助口腔氣管插管術及氣管內注射進行介紹。

• 鼻內滴注法

鼻內滴注法是一種直接的AAV感染法，操作簡單且對設備要求低，對新手實驗員也同樣適用。缺點是AAV顆粒容易沉積在上呼吸道（鼻道、鼻竇和咽）和胃腸道，如果需要有效地感染到下呼吸道，則可能需要更大劑量的AAV才能實現。

• 腹腔注射氯胺酮和甲苯噻嗪將小鼠麻醉；            

（動物必須處于足夠深的麻醉狀態以防止運動或對載體的反應而打噴嚏或咳嗽）

（2）將小鼠以背臥姿勢固定在嚙齒動物工作臺上；

（3）將門牙環置于小鼠上門牙上，并將尼龍搭扣連接到嚙齒動物工作臺下表面的相應尼龍搭扣上；

（4）慢慢地將AAV懸液通過小鼠鼻孔內壁逐滴滴入，為保證最大地肺部感染效率，最小體積為50μL（每個鼻孔25μL），最大體積為75μL（每個鼻孔37.5μL）。待小鼠呼吸恢復正常后，再滴入一次75μL的AAV懸液；

（5）將小鼠輕輕從工作臺拿下，并將頭部和胸部用折疊的紙巾小幅度墊高，以保證小鼠順暢的呼吸；           

（6）小鼠蘇醒后，放回鼠籠。

• 內鏡輔助口腔氣管插管術

口腔氣管插管術能夠將病毒載體直接灌輸入肺中，卻沒有外科手術的風險，并且避免了上呼吸道的病毒顆粒的損失。由于幾乎所有AAV病毒顆粒都會到達肺內，所以要嚴格控制AAV的使用量。同時，與鼻內滴注法相比，口腔氣管插管術需要一些特殊設備，操作起來也稍有難度。

• 腹腔注射氯胺酮和甲苯噻嗪將小鼠麻醉；            

（動物必須處于足夠深的麻醉狀態以防止運動或對載體的反應而打噴嚏或咳嗽）

• 將小鼠以背臥姿勢固定在嚙齒動物工作臺上；

• 將門牙環置于小鼠上門牙上，并將尼龍搭扣連接到             嚙齒動物工作臺下表面的相應尼龍搭扣上；
• 小鼠的背部應完全平放在工作臺上，胸部不應偏向兩側，并用尼龍扣完全固定；

• 用尖頭棉棒把小鼠的舌頭卷起；
• 輕輕地把附有耳鏡的插管鏡插入喉嚨深部的氣管開口處（大約在耳朵前部），插管鏡的凹面應遠離舌頭；
• 輕輕移動耳鏡直到可以看到喉部（有時需稍微旋轉鏡子，以獲得最佳視野）；操作時需注意動作幅度要小，如果只能看到舌頭背面，則需重新移出從頭開始操作；
• 當可以看清喉部時，便可加入一滴2%的利多卡因，在插管前，插管鏡可移出（小于30s），在此期間要定位導管針；
• 30秒以后，重復步驟（3）—（5），重新插入插管鏡，重新找到可以看清喉部的位置；
• 重新可以看清喉部后，導管針首先進入氣管開口，針到位后，插管鏡可以移出，然后引導導管緩緩向下，直到導管的中心（粉色部分）接觸到小鼠門牙，每只小鼠不要嘗試2次以上插入導管；
• 一旦導管到位，要把針移出以便小鼠正常呼吸；
• 確定導管在氣管內的正確位置；
• 用0.35mL的注射器通過導管按照3μL/g體重輸入AAV；
• 立刻使用1mL無針頭注射器輸入0.2mL空氣，并重復2-3次以減少AAV在導管內的殘留；
• 把導管移出；
• 將小鼠輕輕從工作臺拿下，并將頭部和胸部用折疊的紙巾小幅度墊高，以保證小鼠順暢的呼吸；
• 對小鼠狀態進行監測直到其蘇醒，預計在24到36小時之內會恢復輕到中度的呼吸。

• 氣管內注射

與鼻內滴注相比，氣管內注射能夠提高AAV進入肺部的效率；而與口腔氣管插管法相比，設備更簡單，操作更容易。與此同時，氣管內注射具有極高的外科手術風險，包括出血、切口開裂、感染以及較長的恢復期等。不僅如此，由于小鼠氣管窄小，也很容易出現失誤，將AAV注射到氣管周圍組織或食管中去。

• 腹腔注射氯胺酮和甲苯噻嗪將小鼠麻醉；            

（動物必須處于足夠深的麻醉狀態以防止運動或對載體的反應而打噴嚏或咳嗽）

• 將小鼠以背臥姿勢固定在嚙齒動物工作臺上，固定好下巴和四支前端，并保證小鼠在45°斜面上，頭略微抬高；
• 去除小鼠頸腹側的毛發（從喉嚨至胸）；
• 使用濕潤的紗布海綿清洗脫毛區域，再用含氯溶液擦拭皮膚，最后用70%酒精擦拭；
• 在小鼠頸上部切一4mm左右切口；
• 使用組織鑷輕輕穿過皮下組織，找到頸部帶狀肌覆蓋的氣管；
• 在帶狀肌上輕輕切口暴露氣管；
• 一旦可以看到氣管，將針頭斜面向上平行插入氣管，針尖指向肺部，按照3μL/g體重輸入AAV，然后將針拔出；
• 將切口縫合或使用皮膚膠水粘合；
• 將小鼠輕輕從工作臺拿下，并將頭部和胸部用折疊的紙巾小幅度墊高，以保證小鼠順暢的呼吸；
• 對小鼠狀態進行監測直到其蘇醒。