2016年7月14日發表于Cell雜志。

 

 

 

   由于細胞異質性的存在，單細胞層面的分析就變得十分重要。目前對于單細胞分析的方法主要還是通過化學、生物學的方法進行裂解后，提取內容物進行分析，然而這種方法往往會對樣本造成一些損傷。直接提取活細胞具有諸多優點，但是操作苦難。如今一種全新使用FluidFM科技的技術新報道有望提供一種活細胞提取新型的簡易方法。

 

   在本文中，作者對首先建立了一種使用FluidFM提取細胞的方法。他們嘗試了各種提取量以確定使用FluidFM能夠對細胞提取的最大量。在實驗中他們發現使用FluidFM抽取4 pL的細胞質并觀測，發現82%的細胞依然存活，如圖1B所示。但是如果將抽取量加大到4.5 pL則無細胞能夠存活。而對細胞核而言抽取0.6 pL后，有86%的細胞依舊存活，如圖1A。而在0.7 pL或以上的體積提取則不可避免的導致細胞死亡，如圖1B所示。隨后他們對提取后細胞的存活狀況進行了考察。而后他們繼續對提取過的細胞進行觀察，結果發現這些細胞的功能并沒有受到影響。細胞能夠在提取后約30小時后正常分裂，如圖1E所示。因此作者認為使用FluidFM提取的最大量為細胞核0.6 pL和細胞質4pL。

圖1. 細胞存活率檢測 A)原生細胞的體積分布圖，虛線為平均值，點線為最大值和最小值；B)細胞提取體積與活細胞數之間的關系。C)活細胞細胞核提取后GFP的變化；D)死細胞細胞核提取后GFP的變化；E)活細胞提取后（2.9 pL）后對細胞形態的連續觀測。

 

   對于細胞亞結構的觀察，往往對于揭示細胞病變有著重要的意義。然而細胞裂解的傳統手段往往會產生大量的碎片，因此對細胞器的觀察造成了諸多困難。在本篇報道中，作者通過使用FluidFM設備提取細胞內容物，在低溫環境下轉移到透射電鏡的銅網上，然后進行負染色和揮干，之后將片子放到透射電鏡下觀察，并使用傳統裂解方法得到單細胞溶液同時鋪設在銅網上進行對比。通過觀察他們發現，使用FluidFM技術得到的細胞提取物能夠觀察到大泡狀的結構、小球狀的結構和長絲類的結構，如圖2C所示。而相比之下細胞裂解法得到的結果卻不盡人意，如圖2D所示。

圖2. 細胞提取物負染色電鏡圖 A)電鏡樣本制作的示意圖；B)提取液滴在電鏡銅網上的放大圖；C)FluidFM技術的細胞提取物電鏡下的圖像；D)普通裂解法的細胞提取物電鏡下的圖像。

 

   酶活力的檢測對于探尋細胞異質性有著十分重要的意義。因此作者也對FluidFM提取的細胞提取物進行了對比。首先作者通過β-半乳糖苷酶實驗來測定提取蛋白的完整性。通過測定酶解底物產生的熒光素的熒光強度，他們成功觀察到熒光強度隨時間而增加，說明提取物中的蛋白沒有被破壞，如圖3C、D所示。隨后作者又對不同細胞進行了不同酶活力的檢驗，結果顯示無論是LacZ轉基因HeLa細胞上還是在測定HeLa細胞的Caspase3酶上均取得了成功，如圖3 E、F所示。

圖3. 酶活性分析 A)細胞提取分析的示意圖；B)將提取的3 pL細胞提取物放到預先液封的微孔中；C)酶解底物產生熒光素的熒光強度變化，熒光在1小時后可見。D)圖形量化熒光強度時間表；E)LacZ轉基因細胞和非轉基因細胞之間β-半乳糖苷酶活性的差異；F）Caspase3酶活力測定。

   單細胞層面的基因表達通常需要反轉錄或者PCR擴增，之后使用qPCR測定。而在此之前往往需要將細胞裂解，而作者他們采用了與傳統方法不同的策略。他們首先創建了使用FluidFM直接從活細胞中提取大約0.01 pg RNA，并用普通PCR管合成cDNA并進行qPCR檢測，如圖4A所示。由于如此小的提取量是不能直接放到PCR管里面的，所以他們采取的策略是首先將提取液注入1uL水中，然后再轉移到PCR管中，進行合成和檢測如圖6B所示。他們檢測了兩種管家基因beta-actin (ACTB)beta-2-microglobulin (B2M)以及GFP mRNA的表達量。在21個樣本中有90%的樣本成功檢測到至少1中基因的表達，其中2/3的樣本可以同時檢測到三種基因的表達。而對細胞核的檢測中，也能夠檢測到至少一種基因的表達，如圖4C所示。在對比同一細胞同時提取細胞質（1.7 pL）和細胞核（1.3 pL）中這三種基因的表達時，可以發現兩者基本相同，如圖4D所示。

圖4 A)單細胞提取mRNA轉錄實驗的示意圖；B)將提取物放入液滴中的方法；C) ERCC spike 為對照，測定細胞質中GFP、B2M、ACTB的Ct值；D)對同一細胞的細胞質與細胞核進行提取并測定Ct值。

 

   隨著生物研究越發趨于微觀化，對于分析單個細胞的需求變得越來越大。但是由于單個細胞體積小，所能夠提取出的物質相比以前細胞群落分析來說，難度顯著提高。這不僅對檢測儀器的靈敏度有了新的更高的要求，也同時對樣本本身的質量也提出了更高的指標。本篇中使用FluidFM提取活細胞所取得的樣本質量相比于傳統裂解手段有了明顯的提高，從而取得了令人滿意的結果。另外這種方法控制提取量后，甚至能夠做到不殺死細胞的情況下完成提取，這使得對于對單個細胞代謝測定的追蹤成為了可能。

 

 

   多功能單細胞顯微操作系統--FluidFM BOT，是將原子力系統、微流控系統、細胞培養系統為一體的單細胞操作系統。主要功能包括單細胞注射、單細胞提取以及單細胞分離。

   FluidFM BOT極大的方便了單細胞水平的研究，尤其適合應用于精準醫療、單細胞生物學、單細胞質譜、單細胞基因編輯、藥物研發等領域。

 

 

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