基因編輯進展梳理 Part I CRISPR系統拓展及機制研究篇
基因編輯技術是指對目標基因進行編輯，實現對特定DNA片段的敲除、插入等。自CRISPR/Cas9基因編輯技術問世以來，取得了一系列重大突破，并相繼在2012、2013、2015和2017年被Science雜志評為十大科學進展之一。因此，CRISPR/Cas9以其操作簡便和成本低廉等優勢受到了眾多研究者和投資者的青睞。
如下圖所示：從2011到2018年，NIH對CRISPR相關研究的資助從500多萬美元快速增長到11億美元，而且CRISPR相關科學出版物的數量也從最初的87篇急劇增長到3917篇，這些數據反映了CRISPR /Cas9的巨大潛在價值。
2018年，CRISPR系統繼續發力，在多個領域取得突破性的進展，本期我們就先從CRISPR系統開發及機制研究方面來梳理一下相關的重大事件。
一、新型CRISPR系統繼續拓展基因組編輯范圍
自2013年最早公布的spCas9以來[1]，科學家一直致力于在復雜的細菌群體中尋找更多Cas9的同系物來拓展基因編輯工具文庫，以克服現有Cas9系統存在的諸多問題，比如組分太大無法包裝入AAV（腺相關病毒載體）、PAM無法覆蓋整個基因組等等。隨著saCas9，Cpf1和Cas13等相繼問世（如圖），新型基因編輯系統被發現除了編輯DNA，逐漸開始具有編輯RNA以及單雙鏈核苷酸等更多功能，這些新系統的發現不僅拓展了CRISPR的編輯范圍，還延伸了其在諸多領域中的應用。2018年，又有更多有潛力的CRISPR系統相繼被科學家們鑒定并改造。
2017年底張鋒團隊首次報道發現Cas13系統，確認了其可以靶向哺乳動物細胞中的RNA[2]。
2018年3月15日，Salk研究所的Konermann等人為Cas13家族再添一名新成員：Cas13d。這是一種來自腸道細菌（黃化瘤胃球菌XPD3002）的CRISPR/Cas系統，被命名為CasRx。同Cas13類似，CasRx能夠特異性的靶向并切割RNA，但比其他Cas13分子量小20%。同時CasRx介導的敲低效果相對于其他RNA調控方法具有更高的效率和特異性[3]。
2. 環狀核酸酶（ring nuclease）：病毒防御狀態的終止“開關”
III型效應復合物最近被證明可結合入侵病毒的遺傳物質形成一種環狀寡腺苷酸，俗稱第二信使，這一分子會通過CRISPR相關的Rossman折疊結構域結合并激活核糖核酸酶和其他因子來抵抗病毒的入侵，使細胞進入抗病毒狀態。然而這種狀態的持續激活對細胞是不利的，研究人員推測可能存在某種機制，在病毒被清除后關閉這種狀態。2018年9月19日，Malcolm White團隊證實了這一機制，一種被稱為環狀核酸酶的蛋白可特異性地切割環裝寡腺苷酸，從而終止抗病毒狀態。環狀核酸酶的鑒定增加了人們對CRISPR系統的理解 [4]。
3. Cas14: 目前最小型Cas蛋白，為疾病診斷又添一利器
2018年10月18日，Jenifer Doudna團隊發現了迄今為止最小的功能性CRISPR系統---Cas14上。Cas14只有400-700個氨基酸，但它同Cas12和Cas13一樣，能夠靶向切割單鏈DNA ( ssDNA )，且沒有限制性序列要求，因而會盲目地切割細胞內所有的ssDNA。這一特性使得高保真單核苷酸多態性基因分型成為可能。通過進一步的改進，可以為目前已有的診斷系統（DETECTR）提供更多的選擇[5]。
4. Cas12蛋白新組員，進一步拓展CRISPR系統的工具箱
Cas12a（Cpf1）同SpCas9已被作為最為常用的CRISPR-Cas基因編輯工具，并成功應用于基因組工程的各個領域。相比SpCas9，Cas12a以其較小的體積（1228bp）和僅需單個RNA的引導等優勢被廣泛研究和使用[6]。2018年12月6日來自美國Arbor Biotechnologies的研究人員發現了一組新的Cas12蛋白成員：Cas12c、Cas12g、Cas12h和Cas12i。其中的Cas12c、Cas12h和Cas12i具有RNA導向的雙鏈DNA切割活性，還發現Cas12i在CRISPR的crRNA間隔區的互補鏈和非互補鏈上表現出明顯的切割效率差異，這導致dsDNA形成的主要是單鏈切口（nicking）。Cas12g則主要以核糖核酸酶的形式，通過RNA靶向切割單鏈RNA和單鏈DNA。這項研究揭示了V型CRISPR-Cas系統在不同路線進化中的功能多樣性，同時進一步擴展了CRISPR工具箱的運用范疇[7]。
二、工程化CRISPR系統拓展基因組應用范圍
盡管CRISPR-Cas9系統被廣泛用于基因組編輯，但Cas9可以識別的序列范圍受到特定原間隔基相鄰基序( PAM)需求的限制，因此通常很難實現高精度靶向雙鏈DNA斷裂的基因組編輯應用，這包括目前熱門的單堿基編輯和基于CRISPR的基因篩選等技術。隨著Cas9蛋白組學的深入研究，通過人為引入隨機突變來改變PAM特異性的Cas9衍生物使突破這一限制成為可能。目前，科學家主要通過結構信息、基于定向進化的細菌選擇系統來識別不同PAM序列的Cas9功能突變體，這些Cas9突變體具有與野生型SpCas9相當的編輯能力和特異性。這一技術為尋找高精度的Cas9突變體提供了研究方向，極大地拓展了CRISPR系統工具包，為實現CRISPR系統全基因組編輯打開了大門[8]。
1. 建立新型細菌防御系統篩選系統，開發更多具有潛在價值的分子工具
2018年1月25日，來自以色列魏茨曼科學研究所的Rotem Sorek團隊在Science上發文，通過構建出一種掃描所有細菌基因組的計算機程序來研究更多的防御系統基因，將合成的多基因系統插入到天然免疫系統已被滅活的細菌中，通過噬菌體和其他感染因子的篩選，發現細菌存在10種之前未知的細菌免疫防御機制。這些新型防御系統中的任何一種都有可能成為下一種基因編輯工具 [9]。
2. xCas9: 一種能夠識別多種PAM序列的SpCas9突變體
2018年2月28日，David Liu團隊在Nature期刊上發文，他們利用一種噬菌體輔助的連續進化系統 ( PACE ) 進化出一種能夠識別多種PAM序列的SpCas9變體( xCas9 )。xCas9的PAM相容性是迄今為止在所有Cas9識別范圍的哺乳動物中最為廣泛的，并可以應用于人類細胞中，包括靶向轉錄激活、核酸酶介導的基因敲除，單堿基編輯等。值得注意的是，盡管xCas9的PAM兼容性有所擴大，但它的DNA特異性要比SpCas9高得多，在NGG PAMs和非NGG PAMs靶位點中全基因組的脫靶效應也都比spCas9低得多。其中最佳的xCas9 PAMs為NGN，占約四分之一的人類基因組。xCas9的出現極大地擴展了CRISPR系統的DNA靶向范圍，使CRISPR系統變得更加精確和靈活[10]。
2018年9月21日，Osamu Nureki團隊通過合理的設計，開發了一種識別NG而不是NGG的SpCas9突變體（SpCas9-NG）。SpCas9-NG增加了靶向范圍，且具有與野生型SpCas9相似的特異性，還可以與其他編輯器（胞苷脫氨酶）一起使用。因此，SpCas9-NG有效地補充了CRISPR工具箱，將在從基礎研究到臨床治療等廣泛應用中發揮重要的作用[11]。
4. ScCas9: 利用生物信息學發現的PAM僅含一個“G”的Cas9
2018年10月24日，來自美國麻省理工學院的研究人員構建了一個自動化的生物信息學管道，通過目標比對搜索PAMs ( SPAMALOT )，進一步探索了被忽略的Cas9鏈球菌直形菌株的微生物PAM多樣性，發現了一種來自犬鏈球菌的Cas9（ScCas9），展示了其在細菌和人類細胞中的精確編輯能力。ScCas9的 PAM序列為5’-NNGTT-3’，且僅含一個堿基G，因此能靶向SpCas9不能的靶DNA序列且位點更多。ScCas9即可作為替代的基因組編輯工具，也可作為發現新的鏈球菌PAM特異性的功能平臺[12]。
三、CRISPR系統核酸酶作用機制研究取得階段性進展
Cas蛋白是CRISPR/Cas系統中的一類核酸酶，目前已鑒定出至少45個Cas蛋白家族。研究人員已通過冷凍電鏡技術來解析其蛋白結構以及作用機制，為認識基因編輯系統的應用以及改造CRISPR系統提供了基本的結構和理論基礎[13]�，F在，各種新型Cas蛋白被陸續發現和解析，這將為開發新型CRISPR系統以及在將來高效地運用于基因治療奠定基礎。
1. 兩篇研究揭示Cas4核酸酶對于CRIPSR免疫反應的重要性
2018年3月27日的，Shiimori團隊在Cell Reports期刊上發文，證明了Cas4核酸酶是間隔序列前體臨近基序( PAMs )靶向選擇所必須的，有助于Cas1和Cas2選擇新的CRISPR間隔物，并賦予天然宿主Synechocystis I- D CRISPR干擾能力[14]。同年，Shiimori團隊于6月7日在Molecular Cell期刊上發表了工作，展示了Cas4在嗜熱古菌P. furiosus中通過DNA序列整合的方式進行CRISPR-Cas免疫反應，并確定了兩種Cas4（Cas4-1和Cas4-2 )在P. furiosus CRISPR間隔區DNA片段的獲取及在原間隔區加工中的關鍵作用。另一方面，Cas4確保CRISPR間隔區在一個特定的方向上整合，最終觸發CRISPR免疫反應[15]�？偠灾@些發現為Cas4核酸酶在CRISPR陣列的關鍵作用，為原間隔區生成和功能間隔區整合提供了體內依據。
盡管CRISPR系統已被廣泛用于生物醫學到生物技術或合成生物學等各個研究領域，但目前人們對其精細的工作機制仍然缺乏詳細了解。今年三篇突破性的研究通過低溫冷凍電鏡技術分別揭示了不同CRISPR系統的結構以及工作機制，為CRISPR/Cas系統的改進及臨床治療提供了重要的理論基礎。
1) I型CRISPR/Cas系統分子作用機制闡釋：2018年7月6日，來自美國康奈爾大學和哈佛醫學院的研究人員在Science期刊上發文，研究利用單顆粒低溫電鏡技術（cryo-EM）解析TfuCascade/R-loop/Cas3三元復合物在R-loop切割前后的結構，揭示了人們困惑的Cas3招募、DNA切割和降解機制。這些研究為理解I型CRISPR/Cas系統的分子作用機制提供了結構基礎[16]。
2) Cas13d功能結構研究：2018年9月20日，美國Salk研究所的科學家們利用冷凍電鏡解析了Cas13d-sgRNA二元復合物和Cas13d-sgRN-靶點RNA三元復合物的結構及一系列動態過程，這使得我們更詳細地看到Cas13d-系統如何被引導到RNA并切割的過程。這為我們改進CRISPR系統，使其更為有效地為RNA的疾病治療奠定基礎[17]。
3) Cas12d構象循環解析：2018年12月13日，來自諾和諾德基金會中心的研究人員利用一種低溫電鏡技術，闡明了Cas12a靶向DNA切割和隨意降解ssDNA的工作機制，揭示了Cas12a切割其靶DNA，釋放非特異性切割活性，激活后降解ssDNA分子等工作機制。這使得我們可以通過調整CRISPR引擎來達到特定的預期效果[18]。
CRISPR/Cas基因編輯系統在人類治療應用方面具有巨大的潛能，充分了解體內編輯系統的修復機制將有助于我們更加高效且準確地進行基因編輯，為安全有效的臨床應用提供充足的理論和技術基礎。
1. 范可尼貧血通路在CRISPR-Cas9編輯形成DSBs修復過程中發揮關鍵作用
2018年8月，美國加州大學伯克利分校的研究人員在Nature Genetics期刊上發表的研究工作，顛覆了之前的“細胞在Cas9酶剪切DNA后修復基因”的假說，研究人員通過CRISPR干擾技術對2000多個基因進行沉默，發現范可尼貧血通路（Fanconi anemia pathway）中的FANCD2蛋白會定位在Cas9誘導的DSBs上，表明它在調節基因組編輯中起著關鍵作用——調節FANCD2蛋白可以提高HDR頻率。同時發現Fanconi貧血途徑同NHEJ無關，而是通過提高同源重組效率使得修復機制轉向單鏈模板修復機制，因而通過調控Fanconi貧血通路的活性可以提高HDR的編輯效率。這一發現將有助于提高在基因組中插入外源DNA的效率，并確保CRISPR編輯獲得預期的結果[19]。
2018年7月19日，來自上海交通大學的吳強課題組在Molecular Cell期刊上發表了團隊的最新研究成果，顛覆了現有的基因編輯理論。他們發現Cas9切割DNA產生的切口會產生突出末端，而不僅僅只有之前報道的平口末端的形式，同時利用高通量測序針對成對導向RNA編輯后DNA修復方式進行分析，發現斷裂末端的修復方式是可預測的，呈現出非常有規律的形式。這一顛覆性的發現為優化和改造基因編輯技術奠定了堅實基礎[20]。
長期以來，在沒有提供體模板的情況下，CRISPR切割后的修復通常被認為是隨機且異質的。2018年11月7日在Nature期刊上HMax W. Shen團隊發現，通過CRISPR/Cas9靶向基因組的2000多個位點來檢測細胞是如何進行修復的，結果顯示無模板的Cas9基因編輯是可預測的，經編輯的基因并不包含大量的變異，而是一種單一的結果。同時他們通過導入這些大數據，建立了一種機器學習模型（indelphi），它可以高精度地預測五個人類和小鼠細胞系中基因編輯的修復結果，并且將這一預測用于測試人類疾病的修復效果。這種模型能將致病基因型精確修復到預測的基因型，從而能夠準確地校正人類疾病相關的突變。這項研究為精確、無模板的基因組編輯建立了基礎[21]。
隨后，2018年11月27日Felicity Allen團隊在Nature 也發文，他們合成構建了超過4萬多對導向RNA和靶向DNA序列的編輯文庫系統探索CRISPR/Cas9的切割修復機制，明確了修復的結果是取決于靶向區域的DNA序列，大多數可再現的突變是單堿基插入、短的缺失或更長的微同源性介導的缺失的結果。同時也利用大數據開發了一種機器學習算法（FORECasT），能夠實現僅使用靶位點DNA序列來預測糾正的結果[22]。這些機制的深入理解和新工具的開發將有助于人們更好地設計基因編輯實驗。
綜上，為大家簡單介紹了2018年新型CRISPR系統的開發及機制研究方面的重要事件。目前CRISPR-Cas9已經成為一種簡單、精確且快速的基因編輯技術，廣泛應用于醫學及農林牧等諸多生命科學相關領域，如醫學中常涉及眼疾、血液病以及其他遺傳病。同時我們也認識到，這一技術依然存在許多問題以及諸多潛力有待繼續研究和拓展，我們相信在不久的將來CRISPR-Cas9將會在各個領域展現其不可估量的巨大價值。
參考文獻：
1. 201302_Science_Multiplex Genome Engineering Using CRISPR-Cas Systems
2. Cox D B T , Gootenberg J S , Abudayyeh O O , et al. RNA editing with CRISPR-Cas13[J]. Science, 2017:eaaq0180.
3. Konermann, Silvana, et al. “Transcriptome Engineering with RNA-Targeting Type VI-D CRISPR Effectors.” Cell (2018) pii: S0092-8674(18)30207-1.
4. Athukoralage J S , Rouillon C , Graham S , et al. Ring nucleases deactivate type III CRISPR ribonucleases by degrading cyclic oligoadenylate[J]. Nature, 2018.
5. Lucas B. Harrington1,*,†, David Burstein2,*,‡, Janice S. Chen et al. Programmed DNA destruction by miniature CRISPR-Cas14 enzymes. Science, 2018.
6. Zetsche B , Gootenberg J , Abudayyeh O , et al. Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System[J]. Cell, 2015:S0092867415012003.
7. Winston X. Yan et al. Functionally diverse type V CRISPR-Cas systems, 2018, doi:10.1126/science.aav7271.
8. Kleinstiver B P , Prew M S , Tsai S Q , et al. Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities[J]. Nature, 2015, 523(7561):481-485.
9. Doron S , Melamed S , Ofir G , et al. Systematic discovery of antiphage defense systems in the microbial pangenome[J]. Science, 2018:eaar4120.
10. Hu J H , Miller S M , Geurts M H , et al. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity[J]. Nature.
11. Hiroshi Nishimasu, Xi Shi, Soh Ishiguro et al. Engineered CRISPR/Cas9 nuclease with expanded targeting space. Science, 21 Sep 2018, 361(6408):1259-1262, doi:10.1126/science.aas9129.
12. Pranam Chatterjee1,2,*,*,terjee1,2,*,1,2,*,ered CRISPR/Cas9 nuclease with expanded targeting space. Science, 21 Sep 20ortholog. Science Advances, 24 Oct 2018, 4(10):eaau0766.
13. Jinek M , Jiang F , Taylor D W , et al. Structures of Cas9 Endonucleases Reveal RNA-Mediated Conformational Activation[J]. Science, 2014, 343(6176):1247997.
14. Sebastian N. Kieper, Cristóbal Almendros, Juliane Behler et al. Cas4 Facilitates PAM-Compatible Spacer Selection during CRISPR Adaptation. Cell Reports, 27 March 2018, 22(13):3377–3384, doi:10.1016/j.celrep.2018.02.103.
15. Masami S , Garrett S C , Graveley B R , et al. Cas4 Nucleases Define the PAM, Length, and Orientation of DNA Fragments Integrated at CRISPR Loci[J]. Molecular Cell, 2018, 70(5):814-824.e6.
16. Yibei X , Min L , Dolan A E , et al. Structure basis for RNA-guided DNA degradation by Cascade and Cas3[J]. Science, 2018:eaat0839.
17. Zhang C , Konermann S , Brideau N J , et al. Structural Basis for the RNA-Guided Ribonuclease Activity of CRISPR-Cas13d[J]. Cell, 2018, 175(1):212-223.e17.
18. Stefano Stella，Pablo Mesa，Johannes Thomsen，et al. Conformational Activation Promotes CRISPR-Cas12a Catalysis and Resetting of the Endonuclease Activity, Cell (2018). DOI: 10.1016/j.cell.2018.10.045.
19. Chris D. Richardson, Katelynn R. Kazane, Sharon J. Feng et al. CRISPR–Cas9 genome editing in human cells occurs via the Fanconi anemia pathway. Nature Genetics, August 2018, 50(8):1132–1139, doi:10.1038/s41588-018-0174-0.
20. Precise and Predictable CRISPR Chromosomal Rearrangements Reveal Principles of Cas9-mediated Nucleotide Insertion
21. Max W. Shen et al., Predictable and precise template-free CRISPR editing of pathogenic variants, Nature, 2018, DOI: 10.1038/s41586-018-0686-x.
22. Felicity Allen et al, Predicting the mutations generated by repair of Cas9-induced double-strand breaks, Nature Biotechnology (2018). DOI: 10.1038/nbt.4317.
如下圖所示：從2011到2018年，NIH對CRISPR相關研究的資助從500多萬美元快速增長到11億美元，而且CRISPR相關科學出版物的數量也從最初的87篇急劇增長到3917篇，這些數據反映了CRISPR /Cas9的巨大潛在價值。
圖1. 2011-2018年期間CRISPR研究經費（左）及出版物數量逐年上升（右）（來源NIH）
2018年，CRISPR系統繼續發力，在多個領域取得突破性的進展，本期我們就先從CRISPR系統開發及機制研究方面來梳理一下相關的重大事件。
一、新型CRISPR系統繼續拓展基因組編輯范圍
自2013年最早公布的spCas9以來[1]，科學家一直致力于在復雜的細菌群體中尋找更多Cas9的同系物來拓展基因編輯工具文庫，以克服現有Cas9系統存在的諸多問題，比如組分太大無法包裝入AAV（腺相關病毒載體）、PAM無法覆蓋整個基因組等等。隨著saCas9，Cpf1和Cas13等相繼問世（如圖），新型基因編輯系統被發現除了編輯DNA，逐漸開始具有編輯RNA以及單雙鏈核苷酸等更多功能，這些新系統的發現不僅拓展了CRISPR的編輯范圍，還延伸了其在諸多領域中的應用。2018年，又有更多有潛力的CRISPR系統相繼被科學家們鑒定并改造。
圖2. 近年來被報道出的 Cas9同系物
1. CasRx：更強版本的Cas13系統2017年底張鋒團隊首次報道發現Cas13系統，確認了其可以靶向哺乳動物細胞中的RNA[2]。
2018年3月15日，Salk研究所的Konermann等人為Cas13家族再添一名新成員：Cas13d。這是一種來自腸道細菌（黃化瘤胃球菌XPD3002）的CRISPR/Cas系統，被命名為CasRx。同Cas13類似，CasRx能夠特異性的靶向并切割RNA，但比其他Cas13分子量小20%。同時CasRx介導的敲低效果相對于其他RNA調控方法具有更高的效率和特異性[3]。
2. 環狀核酸酶（ring nuclease）：病毒防御狀態的終止“開關”
III型效應復合物最近被證明可結合入侵病毒的遺傳物質形成一種環狀寡腺苷酸，俗稱第二信使，這一分子會通過CRISPR相關的Rossman折疊結構域結合并激活核糖核酸酶和其他因子來抵抗病毒的入侵，使細胞進入抗病毒狀態。然而這種狀態的持續激活對細胞是不利的，研究人員推測可能存在某種機制，在病毒被清除后關閉這種狀態。2018年9月19日，Malcolm White團隊證實了這一機制，一種被稱為環狀核酸酶的蛋白可特異性地切割環裝寡腺苷酸，從而終止抗病毒狀態。環狀核酸酶的鑒定增加了人們對CRISPR系統的理解 [4]。
3. Cas14: 目前最小型Cas蛋白，為疾病診斷又添一利器
2018年10月18日，Jenifer Doudna團隊發現了迄今為止最小的功能性CRISPR系統---Cas14上。Cas14只有400-700個氨基酸，但它同Cas12和Cas13一樣，能夠靶向切割單鏈DNA ( ssDNA )，且沒有限制性序列要求，因而會盲目地切割細胞內所有的ssDNA。這一特性使得高保真單核苷酸多態性基因分型成為可能。通過進一步的改進，可以為目前已有的診斷系統（DETECTR）提供更多的選擇[5]。
4. Cas12蛋白新組員，進一步拓展CRISPR系統的工具箱
Cas12a（Cpf1）同SpCas9已被作為最為常用的CRISPR-Cas基因編輯工具，并成功應用于基因組工程的各個領域。相比SpCas9，Cas12a以其較小的體積（1228bp）和僅需單個RNA的引導等優勢被廣泛研究和使用[6]。2018年12月6日來自美國Arbor Biotechnologies的研究人員發現了一組新的Cas12蛋白成員：Cas12c、Cas12g、Cas12h和Cas12i。其中的Cas12c、Cas12h和Cas12i具有RNA導向的雙鏈DNA切割活性，還發現Cas12i在CRISPR的crRNA間隔區的互補鏈和非互補鏈上表現出明顯的切割效率差異，這導致dsDNA形成的主要是單鏈切口（nicking）。Cas12g則主要以核糖核酸酶的形式，通過RNA靶向切割單鏈RNA和單鏈DNA。這項研究揭示了V型CRISPR-Cas系統在不同路線進化中的功能多樣性，同時進一步擴展了CRISPR工具箱的運用范疇[7]。
二、工程化CRISPR系統拓展基因組應用范圍
盡管CRISPR-Cas9系統被廣泛用于基因組編輯，但Cas9可以識別的序列范圍受到特定原間隔基相鄰基序( PAM)需求的限制，因此通常很難實現高精度靶向雙鏈DNA斷裂的基因組編輯應用，這包括目前熱門的單堿基編輯和基于CRISPR的基因篩選等技術。隨著Cas9蛋白組學的深入研究，通過人為引入隨機突變來改變PAM特異性的Cas9衍生物使突破這一限制成為可能。目前，科學家主要通過結構信息、基于定向進化的細菌選擇系統來識別不同PAM序列的Cas9功能突變體，這些Cas9突變體具有與野生型SpCas9相當的編輯能力和特異性。這一技術為尋找高精度的Cas9突變體提供了研究方向，極大地拓展了CRISPR系統工具包，為實現CRISPR系統全基因組編輯打開了大門[8]。
1. 建立新型細菌防御系統篩選系統，開發更多具有潛在價值的分子工具
2018年1月25日，來自以色列魏茨曼科學研究所的Rotem Sorek團隊在Science上發文，通過構建出一種掃描所有細菌基因組的計算機程序來研究更多的防御系統基因，將合成的多基因系統插入到天然免疫系統已被滅活的細菌中，通過噬菌體和其他感染因子的篩選，發現細菌存在10種之前未知的細菌免疫防御機制。這些新型防御系統中的任何一種都有可能成為下一種基因編輯工具 [9]。
2. xCas9: 一種能夠識別多種PAM序列的SpCas9突變體
2018年2月28日，David Liu團隊在Nature期刊上發文，他們利用一種噬菌體輔助的連續進化系統 ( PACE ) 進化出一種能夠識別多種PAM序列的SpCas9變體( xCas9 )。xCas9的PAM相容性是迄今為止在所有Cas9識別范圍的哺乳動物中最為廣泛的，并可以應用于人類細胞中，包括靶向轉錄激活、核酸酶介導的基因敲除，單堿基編輯等。值得注意的是，盡管xCas9的PAM兼容性有所擴大，但它的DNA特異性要比SpCas9高得多，在NGG PAMs和非NGG PAMs靶位點中全基因組的脫靶效應也都比spCas9低得多。其中最佳的xCas9 PAMs為NGN，占約四分之一的人類基因組。xCas9的出現極大地擴展了CRISPR系統的DNA靶向范圍，使CRISPR系統變得更加精確和靈活[10]。
圖3. PACE-噬菌體輔助連續進化器模式圖[10]
3. SpCas9-NG：一種識別“NG”PAM序列的Cas92018年9月21日，Osamu Nureki團隊通過合理的設計，開發了一種識別NG而不是NGG的SpCas9突變體（SpCas9-NG）。SpCas9-NG增加了靶向范圍，且具有與野生型SpCas9相似的特異性，還可以與其他編輯器（胞苷脫氨酶）一起使用。因此，SpCas9-NG有效地補充了CRISPR工具箱，將在從基礎研究到臨床治療等廣泛應用中發揮重要的作用[11]。
4. ScCas9: 利用生物信息學發現的PAM僅含一個“G”的Cas9
2018年10月24日，來自美國麻省理工學院的研究人員構建了一個自動化的生物信息學管道，通過目標比對搜索PAMs ( SPAMALOT )，進一步探索了被忽略的Cas9鏈球菌直形菌株的微生物PAM多樣性，發現了一種來自犬鏈球菌的Cas9（ScCas9），展示了其在細菌和人類細胞中的精確編輯能力。ScCas9的 PAM序列為5’-NNGTT-3’，且僅含一個堿基G，因此能靶向SpCas9不能的靶DNA序列且位點更多。ScCas9即可作為替代的基因組編輯工具，也可作為發現新的鏈球菌PAM特異性的功能平臺[12]。
三、CRISPR系統核酸酶作用機制研究取得階段性進展
Cas蛋白是CRISPR/Cas系統中的一類核酸酶，目前已鑒定出至少45個Cas蛋白家族。研究人員已通過冷凍電鏡技術來解析其蛋白結構以及作用機制，為認識基因編輯系統的應用以及改造CRISPR系統提供了基本的結構和理論基礎[13]�，F在，各種新型Cas蛋白被陸續發現和解析，這將為開發新型CRISPR系統以及在將來高效地運用于基因治療奠定基礎。
1. 兩篇研究揭示Cas4核酸酶對于CRIPSR免疫反應的重要性
2018年3月27日的，Shiimori團隊在Cell Reports期刊上發文，證明了Cas4核酸酶是間隔序列前體臨近基序( PAMs )靶向選擇所必須的，有助于Cas1和Cas2選擇新的CRISPR間隔物，并賦予天然宿主Synechocystis I- D CRISPR干擾能力[14]。同年，Shiimori團隊于6月7日在Molecular Cell期刊上發表了工作，展示了Cas4在嗜熱古菌P. furiosus中通過DNA序列整合的方式進行CRISPR-Cas免疫反應，并確定了兩種Cas4（Cas4-1和Cas4-2 )在P. furiosus CRISPR間隔區DNA片段的獲取及在原間隔區加工中的關鍵作用。另一方面，Cas4確保CRISPR間隔區在一個特定的方向上整合，最終觸發CRISPR免疫反應[15]�？偠灾@些發現為Cas4核酸酶在CRISPR陣列的關鍵作用，為原間隔區生成和功能間隔區整合提供了體內依據。
圖4. Cas4的作用機制[14-15]
2. 冷凍電鏡技術助力進一步解析CRISPR/Cas系統工作機理盡管CRISPR系統已被廣泛用于生物醫學到生物技術或合成生物學等各個研究領域，但目前人們對其精細的工作機制仍然缺乏詳細了解。今年三篇突破性的研究通過低溫冷凍電鏡技術分別揭示了不同CRISPR系統的結構以及工作機制，為CRISPR/Cas系統的改進及臨床治療提供了重要的理論基礎。
1) I型CRISPR/Cas系統分子作用機制闡釋：2018年7月6日，來自美國康奈爾大學和哈佛醫學院的研究人員在Science期刊上發文，研究利用單顆粒低溫電鏡技術（cryo-EM）解析TfuCascade/R-loop/Cas3三元復合物在R-loop切割前后的結構，揭示了人們困惑的Cas3招募、DNA切割和降解機制。這些研究為理解I型CRISPR/Cas系統的分子作用機制提供了結構基礎[16]。
2) Cas13d功能結構研究：2018年9月20日，美國Salk研究所的科學家們利用冷凍電鏡解析了Cas13d-sgRNA二元復合物和Cas13d-sgRN-靶點RNA三元復合物的結構及一系列動態過程，這使得我們更詳細地看到Cas13d-系統如何被引導到RNA并切割的過程。這為我們改進CRISPR系統，使其更為有效地為RNA的疾病治療奠定基礎[17]。
3) Cas12d構象循環解析：2018年12月13日，來自諾和諾德基金會中心的研究人員利用一種低溫電鏡技術，闡明了Cas12a靶向DNA切割和隨意降解ssDNA的工作機制，揭示了Cas12a切割其靶DNA，釋放非特異性切割活性，激活后降解ssDNA分子等工作機制。這使得我們可以通過調整CRISPR引擎來達到特定的預期效果[18]。
圖5. 低溫冷凍電鏡技術揭示了CRISPR系統的結構以及工作機制[16-18]
四、基于CRISPR系統的基因編輯研究取得突破性進展CRISPR/Cas基因編輯系統在人類治療應用方面具有巨大的潛能，充分了解體內編輯系統的修復機制將有助于我們更加高效且準確地進行基因編輯，為安全有效的臨床應用提供充足的理論和技術基礎。
1. 范可尼貧血通路在CRISPR-Cas9編輯形成DSBs修復過程中發揮關鍵作用
2018年8月，美國加州大學伯克利分校的研究人員在Nature Genetics期刊上發表的研究工作，顛覆了之前的“細胞在Cas9酶剪切DNA后修復基因”的假說，研究人員通過CRISPR干擾技術對2000多個基因進行沉默，發現范可尼貧血通路（Fanconi anemia pathway）中的FANCD2蛋白會定位在Cas9誘導的DSBs上，表明它在調節基因組編輯中起著關鍵作用——調節FANCD2蛋白可以提高HDR頻率。同時發現Fanconi貧血途徑同NHEJ無關，而是通過提高同源重組效率使得修復機制轉向單鏈模板修復機制，因而通過調控Fanconi貧血通路的活性可以提高HDR的編輯效率。這一發現將有助于提高在基因組中插入外源DNA的效率，并確保CRISPR編輯獲得預期的結果[19]。
圖6. 范科尼貧血( FA )途徑介導的雙鏈斷裂( DSB )修復[19]
2. 精準且可預測的CRISPR染色體重排揭示Cas9介導的堿基插入規律2018年7月19日，來自上海交通大學的吳強課題組在Molecular Cell期刊上發表了團隊的最新研究成果，顛覆了現有的基因編輯理論。他們發現Cas9切割DNA產生的切口會產生突出末端，而不僅僅只有之前報道的平口末端的形式，同時利用高通量測序針對成對導向RNA編輯后DNA修復方式進行分析，發現斷裂末端的修復方式是可預測的，呈現出非常有規律的形式。這一顛覆性的發現為優化和改造基因編輯技術奠定了堅實基礎[20]。
圖7. CRISPR系統切割后的修復是精準且可預測的[20]
3. 無模板CRISPR/Cas9基因編輯的精準性被揭示長期以來，在沒有提供體模板的情況下，CRISPR切割后的修復通常被認為是隨機且異質的。2018年11月7日在Nature期刊上HMax W. Shen團隊發現，通過CRISPR/Cas9靶向基因組的2000多個位點來檢測細胞是如何進行修復的，結果顯示無模板的Cas9基因編輯是可預測的，經編輯的基因并不包含大量的變異，而是一種單一的結果。同時他們通過導入這些大數據，建立了一種機器學習模型（indelphi），它可以高精度地預測五個人類和小鼠細胞系中基因編輯的修復結果，并且將這一預測用于測試人類疾病的修復效果。這種模型能將致病基因型精確修復到預測的基因型，從而能夠準確地校正人類疾病相關的突變。這項研究為精確、無模板的基因組編輯建立了基礎[21]。
隨后，2018年11月27日Felicity Allen團隊在Nature 也發文，他們合成構建了超過4萬多對導向RNA和靶向DNA序列的編輯文庫系統探索CRISPR/Cas9的切割修復機制，明確了修復的結果是取決于靶向區域的DNA序列，大多數可再現的突變是單堿基插入、短的缺失或更長的微同源性介導的缺失的結果。同時也利用大數據開發了一種機器學習算法（FORECasT），能夠實現僅使用靶位點DNA序列來預測糾正的結果[22]。這些機制的深入理解和新工具的開發將有助于人們更好地設計基因編輯實驗。
綜上，為大家簡單介紹了2018年新型CRISPR系統的開發及機制研究方面的重要事件。目前CRISPR-Cas9已經成為一種簡單、精確且快速的基因編輯技術，廣泛應用于醫學及農林牧等諸多生命科學相關領域，如醫學中常涉及眼疾、血液病以及其他遺傳病。同時我們也認識到，這一技術依然存在許多問題以及諸多潛力有待繼續研究和拓展，我們相信在不久的將來CRISPR-Cas9將會在各個領域展現其不可估量的巨大價值。
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