為了得到穩定及可重復的保留時間，在分析之前用流動相充分平衡HILIC柱，必須確保在固定相表面存在穩定的吸附水層。相似的，在執行一輪梯度洗脫運行后，色譜柱需要用梯度開始的條件重新平衡，形成穩定的吸附水層。
 

   在液相色譜中，為了得到穩定及可重復的保留時間，必須用流動相充分平衡色譜柱到穩定狀態。在等度或者梯度模式下，色譜柱沒有充分的時間平衡，是導致重復分離性差的常見原因。
 

   反向色譜中，在分析之前，為了充分平衡色譜柱，應用至少十倍柱體積的流動相流過色譜柱。表1 顯示通用液相色譜柱規格的近似柱體積。如果升高使用溫度，必須延長平衡時間使色譜柱的溫度達到穩定平衡。
 

表1.全多孔顆粒填裝的常用液相色譜柱規格的近似柱內容積

HILIC模式下，色譜柱平衡時間可稍微延長。因為這樣做可以在硅膠表面建立和維持一個穩定的水化層，那就可以得到穩定和可重復的保留時間。
 

HILIC平衡所需時間在不同固定相、流動相和分析物之間是多樣化，往往具有高度的應用依賴性。應當注意的的是，當使用具有緩沖鹽的流動相時，需要更長的平衡時間。為了獲得的穩定的HILIC方法，因此建議在方法開發過程中進行柱平衡時間檢查和記錄，這樣做有助于方法在未來具有可轉移性。
 

圖1. 一個新廠家廠家且未被使用過的色譜柱，要求實現達到穩定的保留時間的條件下，在等度洗脫中平衡所需的柱體積，藍色代表反相，綠色代表HILIC模式

作為一個通則，新購買的色譜柱在第一次使用時推薦用60-80倍的柱體積溶液來達到完全平衡（圖1）。舉個例子100×4.6mm 的色譜柱，流速1.5mL/min，要求用42-56分鐘達到首次平衡。一旦運行完全結束，色譜柱應根據提供的色譜柱質量檢驗上的指示進行清洗和儲存。下一次運行，使用更短的平衡時間，用20倍柱體積就足夠了（圖2）。
 

圖2. 為了第二次及后續分析達到平衡所需要的色譜柱體積數量。
 

色譜柱：ACE HILIC-A，100×3.0mm，流動相：乙腈：100mM甲酸胺=90:10（pH 4.7），流速：0.43 mL/min，溫度25°C，檢測器：UV 214 nm，樣品：2 -脫氧鳥苷、對羥基苯甲酸、硫酸沙丁胺醇。

梯度洗脫
 

   相似的規定也應用于HILIC色譜法的梯度洗脫。一個新的色譜柱應該在第一次進樣前至少用60-80倍的柱體積的流動相平衡。然后執行梯度分析，一般用10倍柱體積的梯度洗脫方法起始條件的流動相，就足以重新建立平衡同時獲得穩定的保留時間（圖3）。對于HILIC梯度洗脫法保留時間的重復性，梯度洗脫重新平衡時間相比于反相色譜通常更為關鍵。
 

   建議在方法開發過程中徹底評估重新平衡時間，然后準確記錄在正式方法文件中，以確保將來使用該方法的可靠性。
 

   當在HILIC模式梯度洗脫中使用緩沖鹽流動相，應當在整個梯度洗脫過程中保持恒定的緩沖鹽強度。通過混合相同濃度的緩沖鹽在兩個溶劑中很容易實現。注意應避免在高濃度有機相中發生緩沖鹽的沉淀。
 

圖3. 在HILIC梯度洗脫方法中重復進樣之間，應該用相對于20倍柱體積流過的時間來達到重新平衡。

色譜柱：ACE 5 HILIC-A，150×4.6mm，流速：1.5mL/min，溫度25°C，檢測器：254 nm，樣品：茶堿、次黃嘌呤、醋丁洛爾，鳥嘌呤，胞嘧啶，胞苷

流動相：

A：940ml乙腈+（50ml 200mM甲酸胺+ 10ml水）  pH3.0

B：700ml乙腈+（50ml 200mM甲酸胺+ 250ml水 ） pH3.0        

結論
 

    相比于反相色譜，HILIC方法通常需要更長的平衡時間來獲得可重現性的分析物保留時間。推薦在整個方法開發過程中一直評估平衡時間。通過在這個ACE知識卡片列出的指南概要指導下，使用ACE HILIC色譜柱可以開發出可靠的和可重復性的HILIC方法。