成人小腸類器官的培養與分化操作指南
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2011年，Hans Clevers等首先報道了成人小腸類器官的構建方法，人小腸類器官分別具有小腸上皮組織隱窩和絨毛區域細胞的特征，小腸類器官與小腸上皮組織在細胞組成和形態結構上高度相似，并具有良好的短狀吸收和離子轉運功能。人小腸類器官的培養條件與小鼠小腸類器官不同，除了加入基本生長因子外(EGF, Noggin，R-Spondin-1, Wnt-3a)，還需要添加一些激素和維生素類物質，如胃泌素(gastrin)和煙酰胺(Nicotinamide)，可以延長類器官的存活時間，另外加入A83- 01和SB202190，可以抑制類器官的死亡，提高類器官形成率。在這樣的培養條件下，人小腸類器官呈現出芽狀結構，增殖的干細胞處于出芽部位，小腸類器官經過傳代培養，可以存活6個月以上，并且可以保持基因型不變。以上培養條件可用于人類腸道類器官的長期培養與擴增，但卻不能像小鼠類器官那樣可以分化為各種腸上皮細胞，在上述培養條件的基礎上去除Wnt3A、Nicotinamide和SB202190，同時加入DAPT小分子，則可以誘導腸干細胞分化為各種終末分化結腸上皮細胞。人小腸類器官模型的建立，有望推動小腸生理與疾病基礎研究的發展并且在藥物開發、個體化治療、基因治療以及再生醫學等方面具有巨大的應用前景。 |
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◆成人小腸類器官的制備◆ 1. 腸道手術或腸鏡活檢取得的正常腸組織標本保存于4 ℃的Dulbecco′s磷酸鹽緩沖液(DPBS)中運輸，用4 ℃含青霉素和鏈霉素的DPBS反復沖洗標本至洗滌液澄清。
2. 用鑷子輕刮標本黏膜面去除黏液，將小腸組織標本轉移至盛10cｍ細胞培養皿上，加入一定量的DPBS。 3. 使用滅菌彎尖眼科剪，將組織標本剪碎，直至組織塊直徑小于１ｍｍ,使用預冷1%BSA溶液潤洗移液管管壁后，將組織塊轉移至15ml離心管中。待組織塊沉淀后，吸除上清液，加入10ml預冷DPBS, 重懸8-10次。按上述方法漂洗 3-5次，直至上清變澄清。 4. 去除上述澄清液。加入3ml解離緩沖液，使用預冷1%BSA溶液潤洗移液管管壁后，將重懸液轉移至 6孔細胞培養板中，并加入300ulEDTA(50mM)。冰上震蕩消化30min左右，直至大部分隱窩游離。在顯微鏡下觀察，游離的隱窩呈＂臘腸樣＂，隱窩原所在位置呈＂甜甜圈樣。 小腸隱窩消化液：2-5mM的EDTA, 此步驟后可以讓組織碎片自然沉降后去除上清，繼續消化一次 5. 收集消化后的溶液，讓組織碎片通過重力沉降約1min。小心吸出并丟棄消化液，留下足夠的液體以沒過組織碎片。 6. 將組織碎片重懸于預冷的解離緩沖液，并用移液管上下吹打三次。靜置直到大部分腸組織碎片沉降到底部。 7. 小心吸取上清液并使用70μm濾網過濾，將濾液收集于干凈的50mL管中。 8. 重復上述6-7步驟幾次，直至上清中沒有隱窩，將幾次獲得上清收集在一起。 9. 在2-8℃下將上述收集的上清以200×g離心3分鐘。小心地倒出并丟棄上清液。 10. 將沉淀重懸于含有10mL解離緩沖液中。200×g離心3分鐘。輕輕倒出上清液。將腸隱窩沉淀留在管中。根據沉淀量加入適當體積的基礎培養基重懸沉淀，如果單細胞過多，可再次離心，收集上清以去除單細胞。 11. 計數，吸取10μL置于玻璃載玻片或血細胞計數器上。使用倒置顯微鏡，計數10μL樣本中的隱窩數量，200g離心5min，小心吸出并棄去上清。 12.用類器官培養基將隱窩的密度重懸至8-20個/ul，取出150ul隱窩懸液，加入等體積的未稀釋的基質膠混合隱窩，小心地上下吹打十次以充分混勻，注意避免產生氣泡。 13. 吸取50μL懸液，加入到提前預熱的24孔板每個孔中的中心部位，樣品應在每個孔的中心形成圓頂結構。為了防止接種時出現氣泡，槍頭內液體不要全部打出。 14. 將培養板在37°C下靜置10分鐘以待基質膠完全凝固。將平板轉放入培養箱時，應注意不要破壞凝固后的液滴。 15. 使用移液槍沿著孔側壁向每個孔中輕輕地加入500μL室溫(15-25℃)的配制的類器官擴增培養基。不要將培養基從圓頂結構上直接加入。 16. 向其它未接種的孔中加入無菌PBS以保證培養時的濕度。 將培養板的蓋子蓋好，并在37℃和5％CO2下進行培養。 17. 隔天進行完全換液。換液時將移液槍頭放在孔底邊緣小心地將原有液體培養基吸出，并加入為500μL新鮮的室溫類器官培養基。 18. 對于原代培養物，7-14天進行傳代，對于已經傳代的類器官，每7-10天傳代一次，以1：3~1：5的比例進行類器官傳代，以避免在類器官過度生長和空腔內積累過量的碎屑。 操作要點
❶ 鑷子輕刮標本黏膜面去除黏液，否則后續得到的分餾會有很多雜細胞污染。 ❷ 使用移液管(槍頭)前用1%BSA溶液提取潤洗，這樣可以減少隱窩吸附在移液管(槍頭)上，1%BSA可用DMEM培養基配制。
❸ 小腸隱窩消化液用5mM的EDTA，注意EDTA是否有析出，如析出太多會影響終濃度，有必要更換新的EDTA。
❹ 因分離小腸隱窩需要時間較久，建議整個操作在低溫進行，離心機調至4℃，所用試劑溶液放冰上預冷。
❺ EDTA消化后，小腸組織會變松散，在外界機械力作用下，小腸隱窩會從組織中分離出來，可以重復幾次通過外界機械力作用得到不同的分餾組分混合，也可以挑選隱窩含量較高，雜細胞較少的分餾組分種板培養。
❻ 得到分餾組分后進行隱窩計數，用完全培養基重懸隱窩至8~20個/μl，加入等體積基質膠混合，該過程一定要在冰上操作，混合過程切勿產生氣泡，否則影響后續觀察以及隱窩培養狀態，混勻過程可以調小量程，吸取的液體不要全部吹出。
❼ 購買的基質膠在冰上融化后分裝凍存，操作過程中基質膠一定要放在冰上，未用完的液體狀基質膠可以凍存，若凝固后請棄去。
◆成人小腸類器官的傳代培養◆ 1. 在成熟類器官的24孔板中，每孔加入約1ml預冷的細胞回收液，用1ml槍頭吹打板底的基質膠，直到基質膠全部打碎，收集每個孔中的懸液置于15 ml離心管中；
2. 將全部打碎的基質膠懸液冰上震蕩消化10min；可用1ml大槍頭繼續吹打懸液，此過程避免產生氣泡(調制量程到700ul可避免氣泡產生)，可取適量的懸液觀察，直至看不到大塊的類器官團塊為止。
3. 加入10ml預冷的1%BSA溶液進行洗滌，離心棄去上清后用基質膠重懸。基質膠鋪板后加入含有Y-27632的小腸類器官擴增培養基。
4. 傳代中，若隱窩狀態良好可進行1：3傳代，若狀態較差可進行1：1傳代。全程可以維持約6個月的長期傳代擴增，且類器官狀態保持良好。 1. 將需要凍存的類器官冰上放置5～10 min。 2. 收集類器官，步驟同之前傳代收集步驟一致。
3. 離心后棄上清，用800ul的凍存培養液重懸，將懸液移至凍存管中，放入凍存盒中于-80℃冰箱中保存24 h，如需長久保存，則24 h后轉移至液氮罐保存。
復蘇準備：37℃水浴箱
從液氮中取出凍存管后,立即放入37℃水浴中,使之迅速融解。等到凍存管中僅存一小片冰室,迅速將細胞轉移到含9ml冷的基礎培養基中(先將之置于15ml離心管中,放于冰上)。200g 室溫離心5min,棄去上清,加入適量類器官培基重懸后與基質膠混合種板,加入含有Y-27632的小腸類器官擴增培養基。  基礎培養基：將青-鏈霉素( 1%) 、10mM HEPES、L-谷氨酰胺( 1%)加入至DMEM/F-12 培養基，第一次種板需要加入Y-27632，后續換液不需要加入Y-27632。 ◆配制小腸類器官分化培養基◆ |
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