細胞內pH在各種細胞事件中起重要的調節作用，包括細胞生長，鈣調節，酶活性，受體介導的信號轉導，離子轉運，內吞作用，趨化作用，細胞粘附等等。借助pH敏感的熒光指示劑，研究人員能夠以更高的靈敏度、空間分辨率、采樣密度來監控活細胞內的pH波動。

 

通常，細胞的細胞內pH在其各個細胞區室之間會有所不同。例如，胞質溶膠的pH值介于6.8至7.4之間，而酸性細胞器（如溶酶體）的pH值介于4.5至6.0之間。因此，選擇pH指示劑時，重要的是使其酸度系數（pKa）與實驗系統的pH相匹配，我們提供多種熒光pH指示劑，pH指示劑葡聚糖結合物和其他試劑，用于生物系統中的pH的檢測。

 

1. 近中性pH的檢測

 

BCECF及其膜滲透性AM酯是用于測量細胞內pH的最廣泛使用的熒光pH指示劑。它的pKa約為6.98，非常適合測量各種細胞類型的胞質中的pH變化，以及監測近中性環境中的pH變化。BCECF在〜504 nm處有一個最大吸收，在〜440 nm處有一個等吸收點，在〜527 nm處有最大發射。盡管BCECF具有雙重激發的比值特性，但一些特性使比值成像不理想。其等吸收點與最大激發之間距離較大，細胞內保留性較差以及在440 nm處的弱吸收，都導致其信噪比較低。此外，BCECF以異構體的復雜混合物形式提供。

 

RatioWorks™BCFL，BCECF的高性能替代產品

 

RatioWorks™BCFL是AAT Bioquest設計的新型比值型指示劑，用于優化BCECF的不良性能和異構變異性，與BCECF相似，RatioWorks™BCFL的pKa約為7，最大吸收在503 nm處，最大發射在528 nm處。但是，RatioWorks™BCFL具有約454 nm的等吸收點，等吸收點的這個紅移非常適合比值成像，因為它使RatioWorks™BCFL產生的信噪比明顯高于BCECF。

 

RatioWorks™BCFL比值型成像技術使細胞內pH值測定基本上獨立于幾個可變因素，包括染料濃度，光程長度，細胞滲漏和光漂白速率。RatioWorks™BCFL可以作為不滲透膜的酸使用，也可以作為胺反應性琥珀酰亞胺酯用于標記抗體和蛋白質。

 

BCFL激發光譜	BCFL發射光譜

 

RatioWorks™BCFL的主要功能：

 

適用于細胞內pH的單波長成像和比值型成像

信噪比較BCECF高

改善了細胞保留能力，將背景干擾降至最低

單一異構體設計可提供更一致和可重現的結果

適用于熒光顯微鏡，流式細胞儀和基于熒光酶標儀的測定

 

圖1. 使用RatioWorks™BCFL，AM（Cat# 21190）和BCECF，AM（Cat# 21202）產生的標準曲線。將Hela細胞與5 µM RatioWorks™BCFL，AM在37°C下孵育30分鐘。用Spexyte™ Intracellular pH Calibration Buffer Kit（Cat# 21235）中的細胞外緩沖液固定細胞內pH在4.5-8.5之間，取4個數據點的平均值，并用4參數擬合曲線，得到pH 6到8的標準曲線。

 

pH 6.0	pH 8.5

 

圖2. 用RatioWorks™BCFL，AM標記的Hela細胞。將Hela細胞與5 µM RatioWorks™BCFL，AM（Cat# 21190）在37°C 下孵育30分鐘。使用顯微鏡FITC濾光片捕獲圖像。將BCFL，AM溶液與Hela細胞一起溫育，結果顯示RatioWorks™BCFL，AM和染色的細胞質均被均勻攝取。

 

表1. 接近中性pH環境的比值型熒光pH探針

 

指示劑	Ex（nm）	Em（nm）	pKa	規格	貨號
RatioWorks™BCFL，AM	454、503	528	〜7	1mg	21190
RatioWorks™BCFLAcid	454、503	528	〜7	1mg	21189
RatioWorks™BCFL，SE	454、503	528	〜7	1mg	21191
Cell Meter™熒光細胞內pH檢測試劑盒	430、505	535	〜7	1000 Tests	21180
CytoFix™BCECF，AM *長期細胞pH示蹤劑*	440、504	527	〜6.98	1mg	21202
BCECF，AM	440、504	527	〜6.98	1mg	21202
BCECF，AM *超純級*	440、504	527	〜6.98	20x50 µ	21203
BCECF acid * CAS＃：85138-49-4 *	440、504	527	〜6.98	1mg	21201

2. 酸性pH檢測和內吞

 

嗜酸探針，例如PDMPO和AAT Bioquest Protonex™染料，具有獨特的特性，非常適合測量活細胞中偏酸性的細胞器的pH。作為弱堿，由于質子化這些染料能夠選擇性地在溶酶體和其他酸性隔室內積累。這種質子化不僅減少了背景干擾，還激活了其pH依賴性的熒光。

 

RatioWorks™PDMPO，雙重激發|雙重發射比值型pH探針

 

RatioWorks™PDMPO是具有酸性雙激發和雙發射pH探針， 它的pKa〜4.47和獨特的pH依賴性熒光是測量酸性細胞器pH的理想選擇。在接近中性的條件下，當以最大激發光（〜333 nm）激發時，RatioWorks™PDMPO會在〜450 nm處發出強烈的藍色熒光。然而，在更酸性的環境中，該熒光在〜550 nm處迅速轉變為深黃色。RatioWorks™PDMPO在〜386 nm處也表現出二次激發最大值。這使得能夠在配備有紫色激光的流式細胞儀上進行細胞內pH測量。RatioWorks™PDMPO已成功地用作生物硅化過程中的示蹤劑，并已廣泛應用于二氧化硅相關研究中。

 

PDMPO激發光譜	PDMPO發射光譜

 

Protonex™染料，酸性pH指示劑

 

Protonex™Green 500和Protonex™Red 600是AAT Bioquest開發的新型pH敏感熒光染料，用于監測酸性細胞區室（例如內體和溶酶體），從而減少了信號變異性并提高了準確性。在接近中性的環境中，Protonex™染料基本上是無熒光的。直到暴露在酸性環境中，Protonex™染料的熒光強度才會增加。Protonex™Green 500的最佳激發和發射最大值分別為〜445 nm和〜503 nm，而Protonex™Red 600在〜575 nm處激發并在〜597 nm處發射。Protonex™染料可以作為胺反應性琥珀酰亞胺酯用于標記蛋白質和抗體，也可以與葡聚糖或乳膠珠偶聯以研究內吞途徑。

 

Protonex™Green 500激發光譜	Protonex™Red 600發射光譜

 

Protonex™染料的主要特點：

Protonex™Green 500和Protonex™Red 600的pKa約為6.5

Protonex™染料在中性pH下不發熒光，隨著酸化作用熒光強度增加

成功追蹤活細胞內化作用并監測吞噬和內吞途徑

在中性pH值下染料熒光最弱，無需清洗步驟

適用于與其他熒光染料和綴合物的多重分析

用于熒光顯微鏡，流式細胞儀，熒光計等

 

圖3.通過Protonex™Red 600-Latex珠綴合物（Cat# 21209）檢查了RAW 264.7細胞中的吞噬作用。將RAW 264.7細胞與Protonex™600 Latex Beads在生長培養基中孵育4小時。CytoTrace™Green CMFDA（Cat# 22017）用于追蹤活細胞。使用Keyence熒光顯微鏡拍攝圖像（20X）。

 

 

表2.適用于酸性pH環境的比值型和單波長熒光pH指示劑

 

指示劑	Ex（nm）	Em（nm）	pKa	規格	貨號
RatioWorks™PDMPO，AM	333	450、531	約4.47	1mg	21204
RatioWorks™PDMPO Dextran * 10,000 MW *	333	450、531	約4.47	1mg	21211
RatioWorks™PDMPO，SE	333	450、531	約4.47	1mg	21210
Protonex™Green 500	445	503	約6.5	1mg	21215
Protonex™Green 500 WS	445	503	約6.5	1mg	21218
Protonex™Green 500，SE	445	503	約6.5	1mg	21216
Protonex™Green 500葡聚糖	445	503	約6.5	1mg	21217
Protonex™紅色600	575	597	約6.5	1mg	21207
Protonex™Red 600，SE	575	597	約6.5	1mg	21208

 

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