單個外泌體表型分析是將免疫學與光學結合的一種新技術^[1]。該技術首先利用免疫識別將特定的外泌體進行捕獲分離，然后再對目標外泌體的表面標志物及內容物（如攜帶的蛋白質、RNA、DNA及細胞因子）進行定量分析，從而更加全面地反映外泌體的特性。借助單個外泌體表型分析技術，腫瘤學家可以更加深入的分析腫瘤相關的外泌體，以便更好的進行腫瘤的病理生理學研究、早期篩查、診斷以及臨床治療。

單個外泌體表型分析技術在短短兩年時間，備受廣大科研工作者的關注。本文收集了該技術在腫瘤研究領域的相關應用，以供參考。

Cell：大規模腫瘤外泌體蛋白組學研究，揭示可用于腫瘤檢測的新標志物

Hoshino等^[2]通過檢測腫瘤、腫瘤周邊組織以及血清的外泌體蛋白質組，確定了來源于癌細胞的特定蛋白標記物。進一步分析癌癥病人和健康的組織和血清的外泌體蛋白質組，得出的檢測結果的特異性和準確性都達到了90%以上，且通過檢測血清外泌體的內容物可以對腫瘤種類進行判定。

其中，研究人員使用單個外泌體表型分析技術(Exoview)對來源于人血漿的外泌體進行分析，成功檢測到了攜帶moesin和β2-microglobulin蛋白的外泌體（圖1），并對其進行了定量分析。

圖1   人血漿外泌體蛋白表達分析

J   Extracell Vesicles：蛋白質組學應用于惡性黑色素瘤外泌體亞群鑒定

研究表明，黑色素瘤來源的外泌體可以增強腫瘤代謝，且其攜帶的轉運蛋白可能用于臨床診斷。準確分辨外泌體亞型有助于理解外泌體在腫瘤微環境中的作用并確定癌癥的診斷標準。Crescitelli等^[3]為了分辨代謝性黑色素瘤來源的外泌體亞型，開發了分離外泌體的方法，并對分離的外泌體亞型進行了分析。

其中，研究人員將來源于黑色素瘤組織的不同離心轉速分離出來的外泌體，分為large與small兩種。對兩種外泌體，ExoView和ELISA方法都檢測到了CD9，CD63和CD81三種蛋白標記物（圖2a&b）。而Exoview方法同時檢測出了來源于血小板的標記物CD41a，標志著樣本受到微量來源于血液的外泌體污染。

圖2   Exoview（a）與ELISA方法（b）檢測外泌體上的不同蛋白標記物

J   Extracell Vesicles：表達整合蛋白的外泌體促進癌細胞增殖

整合蛋白是由α和β亞基組成的跨膜蛋白。50–150 nm的小外泌體（sEV）普遍含有多種整合蛋白。在腫瘤的發展過程中，整合蛋白的含量會發生變化，因此整合蛋白被認為可能與癌癥相關。其中，αVβ3整合蛋白在人正常前列腺細胞中表達量較低，而在前列腺癌（PrCa）細胞中高表達，有研究表明，αVβ3促進PrCa細胞對細胞外基質的粘附與侵入，但αVβ3在去勢抵抗性前列腺癌（CRPrCa，前列腺癌的一種亞型）的作用仍未有詳細研究。Quaglia等^[4]發現，過表達αVβ3的CRPrCa細胞的sEV可促進腫瘤生長和神經內分泌分化，而不表達αVβ3的細胞的sEV則沒有這樣的效果。

其中，研究人員使用ExoView檢測分離出的sEV是否含有αVβ3。結果表明，對于能夠與αVβ3形成配體的蛋白標記物（除CD41）使用相應抗體而捕獲到的外泌體，均含有αVβ3（圖3）；而對于不與αVβ3形成配體的CD41則沒有檢測到含有αVβ3的外泌體。

圖3   檢測來源于CRPrCa細胞的含αVβ3的特異性外泌體數量

Cells：CD44糖蛋白在胃癌發生中的作用

CD44是一種跨膜糖蛋白，能夠介導細胞間與細胞-基質間相互作用，主要配體為透明質酸（HA）。研究表明，CD44與腫瘤的生長相關，其在腫瘤細胞中高表達，且CD44與HA的結合親和力高，因此納米載體常用HA做表面修飾以作為腫瘤細胞的靶向藥物載體。外泌體是天然的靶向信息傳遞載體，有研究在外泌體中檢測到CD44。Härkönen等^[5]使用胃癌細胞MKN74研究了CD44表達對外泌體分泌，HA合成與腫瘤細胞生長的影響。結果表明，CD44促進了細胞表面和細胞間的HA形成，調控腫瘤微環境；CD44可改變外泌體的物理性質以及靶向性質。

其中，研究人員使用Exoview檢測了MKN74細胞的未經純化的培養基及分離純化后的外泌體中的含CD44以及其他標記物的含量。結果表明，相對于對照組，MOCK（CD44敲除）細胞組在未經純化的培養基及分離純化后的分泌外泌體的數量顯著降低。以上結果表示ExoView可以直接對復雜環境的培養基進行檢測，無需分離純化步驟，且檢測結果具有極高特異性。

圖4   ExoView檢測表達不同蛋白標記物的外泌體數量

在以上的研究中，ExoView系統以極高的靈敏度和特異性準確地檢測了體液與培養基中特定外泌體的含量。外泌體作為癌癥的早期診斷工具，以及應用外泌體載藥的治療方法，今后將成為癌癥診斷與治療研究的重要方向。ExoView將在今后的研究中，給出準確的實驗結果，助力人類最終攻克癌癥。

參考文獻：

[1] Scherr, S. M., Daaboul, G. G., Trueb,   J., Sevenler, D., Fawcett, H., Goldberg, B., ... & Ünlü, M. S. (2016). Real-time capture and   visualization of individual viruses in complex media. ACS nano, 10(2),   2827-2833.

[2] Hoshino, A., Kim, H. S., Bojmar, L.,   Gyan, K. E., Cioffi, M., Hernandez, J., ... & Lyden, D. (2020).   Extracellular vesicle and particle biomarkers define multiple human cancers.   Cell, 182(4), 1044-1061.

[3] Crescitelli, R., Lässer, C., Jang, S.   C., Cvjetkovic, A., Malmhäll, C., Karimi, N., ... & Lötvall, J. (2020).   Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma   tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation.   Journal of extracellular vesicles, 9(1), 1722433.

[4] Quaglia, F., Krishn, S. R., Daaboul,   G. G., Sarker, S., Pippa, R., Domingo-Domenech, J., ... & Languino, L. R.   (2020). Small extracellular vesicles modulated by αVβ3 integrin induce   neuroendocrine differentiation in recipient cancer cells. Journal of   extracellular vesicles, 9(1), 1761072.

[5] Härkönen, K., Oikari, S., Kyykallio,   H., Capra, J., Hakkola, S., Ketola, K., ... & Rilla, K. (2019). CD44s   assembles hyaluronan coat on filopodia and extracellular vesicles and induces   tumorigenicity of MKN74 gastric carcinoma cells. Cells, 8(3), 276.

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