Visikol透明化應用之光控“活電極”腦機接口
在上期的“Visikol應用之序幕篇”中展示了兩類腦機接口：一類是非侵入式的，如為世界杯開球的“機甲”青年平托所戴的“可穿戴式”頭盔，另一類則是侵入式的，像埃隆·馬斯克的Neuralink公司推出的芯片Link V0.9一樣，直接將芯片植入大腦中從而獲取腦信號。與非侵入性方法相比，侵入性方法最大的優點是提供了高的時間和空間分辨率，提高了所獲得信號的質量和信噪比[1]。但是侵入性方法的有一些無法忽視的缺點：可能導致組織損傷[2]、引發神經炎癥反應[3]、信號記錄壽命較低[4]等。一般而言，基于電極的傳感器往往具有更高的時間分辨率，而更具侵入性的傳感器往往會獲得更高的時間分辨率（圖1[5]）。在這種背景下，腦機接口技術的應用面臨著植入物性質、侵入性水平和信號分辨率之間的權衡[3]。因此促進大腦和機器之間通信的神經接口必須與大腦組織兼容，通過生物相容性材料可促進腦相容性神經接口的發展[6]。下面繼續分享上期的彩蛋文獻（一不小心從預印版等到了正式發表）。
圖1. 空間和時間分辨率在目前的腦機接口類型之間的差異[5]
211 mW/mm2
317 mW/mm
423 mW/mm2
528 mW/mm2
634 mW/mm2
視頻1-6. “活電極”μTENN光刺激/光記錄實驗成像結果
生物相容、功能性“活電極”——常規免疫組化方法結合Visikol組織透明化
植入式神經接口的基本設計目標是維持體內的長期功能[3]。可能遇到的障礙中最普遍的可以概括為對植入物的多模式、持續的排異反應（foreign body response，FBR），隨著時間的推移，這種反應會降低腦機接口的效能[8]。FBR是一種對健康組織破壞和大腦中持續存在異物的神經炎癥反應，植入物在大腦中的存在通常會引起持續的炎癥反應，星形膠質細胞和小膠質細胞都會以促炎狀態留在該區域，試圖消除異物[9,10]。而文章中星形膠質細胞增生和小膠質細胞增生的標記物染色顯示，只有適度的宿主炎癥反應（圖3C）。
圖3顯示在小鼠腦內植入μTENN 1周和1個月，組織透明化和切片免疫組織化學結果。其中，μTENN神經元存活并維持預先形成的胞體-軸突結構，其中GFP+/GCaMP+胞體主要定位于微柱終端并由軸突束跨越（圖6）。為了觀察植入1個月的炎癥反應程度，對植入物組織切片進行小膠質細胞/巨噬細胞（Iba-1，紅色）和星形膠質細胞（GFAP，玫紅色）染色，顯示只有少量的宿主神經炎癥反應（圖6C）。在植入的背側區域發現大量密集的GCaMP+胞體（圖6B），管腔內的軸突和樹突橫跨微柱（圖6D）。觀察到背側聚集體沿腦表面或沿微柱進一步擴散，推測是由于細胞從聚集體遷移而增加與宿主組織的相互作用（圖6B）。在某些情況下，從腹側植入物的位置也有高達數毫米的神經元遷移，盡管遷移的存在和程度因植入物而異。總的來說，在活體電極的腹側聚集體中有廣泛的神經突起生長，并有結構證據表明與宿主神經元形成突觸（圖6E和F）。箭頭表示穿透宿主大腦的十個神經突起和假定的突觸形成，虛線表示放大（F）。比例尺，100μm（A至C）、50μm（D和E）和10μm（F）。HST，Hochest。
圖3. μTENN免疫組化結果和Visikol組織透明化成像
簡便、高效的Visikol透明化方法
其中經采用振動切片的方式采集到的100-200um切片至2mm厚切片，均由Visikol透明化化，采用簡單的梯度脫水后，即可直接使用Visikol HISTO透明化試劑，2mm厚切片簡單浸泡4小時（Visikol HISTO-1、HISTO-2分別孵育2小時）即可成像，可解決由于組織光散射特性而限制對超過幾百微米深的神經元成像觀察問題。Visikol HISTO試劑專為生物大樣品透明化而設計，適用于厚度超過1mm的樣品，且不需要去除細胞膜脂質，因此保留了固有的細胞結構（親脂性染料適用），兼容免疫染色，此外透明化結果可逆，可繼續進行相關組學研究。
目前Visikol系列產品，不僅有用于完整動物組織的透明化試劑，還有可用于3D細胞培養模型透明化、動物胎兒骨成像、以及植物樣本透明化等樣本，適用的樣本種類多，可應對廣大科研工作者各類研究需求。目前Visikol透明化所有產品锘海均代理有售，歡迎垂詢！文末為Visikol透明化的小鼠卵巢樣本血管染色成像結果（內皮細胞抗體CD31特異性染色）。
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參考文獻
[1] Abdulkader, S. N. , Atia, A. , & Mostafa, M. S. M. . (2015). Brain computer interfacing: applications and challenges. Egyptian Informatics Journal, 16( 2), 213-230.
[2] Kawala-Sterniuk A, Browarska N, Al-Bakri A, et al. Summary of over Fifty Years with Brain-Computer Interfaces-A Review. Brain Sci. 2021;11(1):43.
[3] Grill WM, Norman SE, Bellamkonda RV. Implanted neural interfaces: biochallenges and engineered solutions. Annu Rev Biomed Eng. 2009;11:1-24.
[4] Kirsch RF, Ajiboye AB, Miller JP. The Reconnecting the Hand and Arm with Brain (ReHAB) Commentary on "An Integrated Brain-Machine Interface Platform With Thousands of Channels". J Med Internet Res. 2019;21(10):e16339.
[5] Martini ML, Oermann EK, Opie NL, Panov F, Oxley T, Yaeger K. Sensor Modalities for Brain-Computer Interface Technology: A Comprehensive Literature Review. Neurosurgery. 2020;86(2):E108-E117.
[6] Jeong YC, Lee HE, Shin A, Kim DG, Lee KJ, Kim D. Progress in Brain-Compatible Interfaces with Soft Nanomaterials. Adv Mater. 2020;32(35):e1907522.
[7] Adewole DO, Struzyna LA, Burrell JC, et al. Development of optically controlled "living electrodes" with long-projecting axon tracts for a synaptic brain-machine interface. Sci Adv. 2021;7(4):eaay5347.
[8] Tresco PA, Winslow BD. The challenge of integrating devices into the central nervous system. Crit Rev Biomed Eng. 2011;39(1):29-44.
[9] Harris JP, Tyler DJ. Biological, mechanical, and technological considerations affecting the longevity of intracortical electrode recordings. Crit Rev Biomed Eng. 2013;41(6):435-456.
[10] Woeppel K, Yang Q, Cui XT. Recent Advances in Neural Electrode-Tissue Interfaces. Curr Opin Biomed Eng. 2017;4:21-31.
圖1. 空間和時間分辨率在目前的腦機接口類型之間的差異[5]
研究內容
由賓夕法尼亞卡倫大學的D. Kacy Cullen科研團隊在腦機接口研究中利用組織工程學方法制備“活電極”：作為工程化的神經微組織（microtissue engineered neural network，微組織工程神經網絡，μTENN），活電極通過與宿主神經元形成突觸，為神經靶細胞與腦表面之間的信號傳遞提供了天然的生物基質。當不再使用任何傳統無機電極材料（例如鉑、鎢、硅）至大腦表面時，全有機物的形式可改善慢性異物反應，潛在地改善長期穩定性（圖2J）。此外，這是一種新型的光控“活電極”：結合光遺傳學（Optogenetics，2010年被Nature Methods選為年度方法，同年被Science認為是近十年來的突破之一，近幾年更是諾獎熱門），提供進入深層神經環路的途徑，而且病毒轉導在植入前僅限于μTENN神經元，因此不受潛在的病毒傳遞風險。
“活電極”巧妙構造——利用單向/雙向μTENN和光遺傳學提供神經環路的輸入/輸出
圖2是“活電極”構造的概念示意圖。μTENN構造包括水凝膠微柱、神經元培養物和細胞外基質腔。（A）1：可定制的亞克力模具，用于制備微柱；2：模具虛線頂視圖表示外徑（外徑；中部）和內徑（內徑；頂部和底部）；3：將匹配內徑的針插入模具中：4：瓊脂糖（藍色）在微柱中熔融：5：拆針拆模后取出微柱。（B）1：具有錐形井的3D打印模具；2：聚二甲基硅氧烷（PDMS）澆鑄的錐形井；3：分離的神經元（綠色）在錐形井中離心形成球狀聚集體；4：24小時后聚集體相圖；5：72小時后共聚焦對聚集體成像結果（GFP標記）。（C） 微柱（灰色）充滿細胞外膠原層粘連蛋白基質（紅色）。然后將神經元聚集體置于微柱末端并在體外培養生長。（D）用分離的神經元得到早期μTENN對最終的網絡結構產生了有限的控制（E）。聚集體（F）表現出強大的軸突生長和更可控的結構，具有離散的胞體區域（G）和神經投射（H）。（I）左圖：可植入活電極的μTENN微柱外型尺寸；中間：單向突觸宿主神經元（紫色），傳遞外部信號至目標皮層區域；右：宿主神經元突觸雙向μTENN，傳遞來自宿主皮層的活動，可通過背側μTENN進行監測。（J） 作為可移植輸入/輸出通道的光遺傳學工程“活電極”。輸入：LED陣列（1）通過光學刺激一個單向的、通道視紫紅質陽性μTENN（2）激活第四層神經元（3）。輸出：第五層神經元（4）突觸一個雙向μTENN（5）；傳遞神經元的活動被記錄于位于大腦表面的光電二極管陣列（6）。比例尺，100μm。
由賓夕法尼亞卡倫大學的D. Kacy Cullen科研團隊在腦機接口研究中利用組織工程學方法制備“活電極”：作為工程化的神經微組織（microtissue engineered neural network，微組織工程神經網絡，μTENN），活電極通過與宿主神經元形成突觸，為神經靶細胞與腦表面之間的信號傳遞提供了天然的生物基質。當不再使用任何傳統無機電極材料（例如鉑、鎢、硅）至大腦表面時，全有機物的形式可改善慢性異物反應，潛在地改善長期穩定性（圖2J）。此外，這是一種新型的光控“活電極”：結合光遺傳學（Optogenetics，2010年被Nature Methods選為年度方法，同年被Science認為是近十年來的突破之一，近幾年更是諾獎熱門），提供進入深層神經環路的途徑，而且病毒轉導在植入前僅限于μTENN神經元，因此不受潛在的病毒傳遞風險。
“活電極”巧妙構造——利用單向/雙向μTENN和光遺傳學提供神經環路的輸入/輸出
圖2是“活電極”構造的概念示意圖。μTENN構造包括水凝膠微柱、神經元培養物和細胞外基質腔。（A）1：可定制的亞克力模具，用于制備微柱；2：模具虛線頂視圖表示外徑（外徑；中部）和內徑（內徑；頂部和底部）；3：將匹配內徑的針插入模具中：4：瓊脂糖（藍色）在微柱中熔融：5：拆針拆模后取出微柱。（B）1：具有錐形井的3D打印模具；2：聚二甲基硅氧烷（PDMS）澆鑄的錐形井；3：分離的神經元（綠色）在錐形井中離心形成球狀聚集體；4：24小時后聚集體相圖；5：72小時后共聚焦對聚集體成像結果（GFP標記）。（C） 微柱（灰色）充滿細胞外膠原層粘連蛋白基質（紅色）。然后將神經元聚集體置于微柱末端并在體外培養生長。（D）用分離的神經元得到早期μTENN對最終的網絡結構產生了有限的控制（E）。聚集體（F）表現出強大的軸突生長和更可控的結構，具有離散的胞體區域（G）和神經投射（H）。（I）左圖：可植入活電極的μTENN微柱外型尺寸；中間：單向突觸宿主神經元（紫色），傳遞外部信號至目標皮層區域；右：宿主神經元突觸雙向μTENN，傳遞來自宿主皮層的活動，可通過背側μTENN進行監測。（J） 作為可移植輸入/輸出通道的光遺傳學工程“活電極”。輸入：LED陣列（1）通過光學刺激一個單向的、通道視紫紅質陽性μTENN（2）激活第四層神經元（3）。輸出：第五層神經元（4）突觸一個雙向μTENN（5）；傳遞神經元的活動被記錄于位于大腦表面的光電二極管陣列（6）。比例尺，100μm。
圖2. “活電極”構造的概念示意圖[7]
光刺激、鈣成像和光記錄
作為對“光控活電極”方法的概念驗證，D. Kacy CullenCullen團隊建立了一個“全光”范式，能夠在體外同時對μTENN聚集體進行光遺傳學控制和光學監測。用通道視紫紅質-2（ChR2）轉導皮層神經元聚集體以進行基于光的神經元激活（“輸入”），用遺傳編碼的熒光鈣reporter RCaMP1b通過AAV1轉導以進行神經元活動的光學讀出（“輸出”）。
以下視頻顯示了大約6mm長的ChR2/RCaMP μTENN的聚合體，在光刺激/光記錄實驗成像結果。右上角紅色箭頭表示在470nm處ChR2+聚集體（視野外）的光學刺激。脈沖光纖輸出功率分別為106、211、317、423、528和634 mW/mm2（視頻1-6）。RCaMP+熒光的增加可以看作是隨著脈沖強度的增加而增加。
作為對“光控活電極”方法的概念驗證，D. Kacy CullenCullen團隊建立了一個“全光”范式，能夠在體外同時對μTENN聚集體進行光遺傳學控制和光學監測。用通道視紫紅質-2（ChR2）轉導皮層神經元聚集體以進行基于光的神經元激活（“輸入”），用遺傳編碼的熒光鈣reporter RCaMP1b通過AAV1轉導以進行神經元活動的光學讀出（“輸出”）。
以下視頻顯示了大約6mm長的ChR2/RCaMP μTENN的聚合體，在光刺激/光記錄實驗成像結果。右上角紅色箭頭表示在470nm處ChR2+聚集體（視野外）的光學刺激。脈沖光纖輸出功率分別為106、211、317、423、528和634 mW/mm2（視頻1-6）。RCaMP+熒光的增加可以看作是隨著脈沖強度的增加而增加。
106 mW/mm2
211 mW/mm2
317 mW/mm
423 mW/mm2
528 mW/mm2
634 mW/mm2
視頻1-6. “活電極”μTENN光刺激/光記錄實驗成像結果
生物相容、功能性“活電極”——常規免疫組化方法結合Visikol組織透明化
植入式神經接口的基本設計目標是維持體內的長期功能[3]。可能遇到的障礙中最普遍的可以概括為對植入物的多模式、持續的排異反應（foreign body response，FBR），隨著時間的推移，這種反應會降低腦機接口的效能[8]。FBR是一種對健康組織破壞和大腦中持續存在異物的神經炎癥反應，植入物在大腦中的存在通常會引起持續的炎癥反應，星形膠質細胞和小膠質細胞都會以促炎狀態留在該區域，試圖消除異物[9,10]。而文章中星形膠質細胞增生和小膠質細胞增生的標記物染色顯示，只有適度的宿主炎癥反應（圖3C）。
圖3顯示在小鼠腦內植入μTENN 1周和1個月，組織透明化和切片免疫組織化學結果。其中，μTENN神經元存活并維持預先形成的胞體-軸突結構，其中GFP+/GCaMP+胞體主要定位于微柱終端并由軸突束跨越（圖6）。為了觀察植入1個月的炎癥反應程度，對植入物組織切片進行小膠質細胞/巨噬細胞（Iba-1，紅色）和星形膠質細胞（GFAP，玫紅色）染色，顯示只有少量的宿主神經炎癥反應（圖6C）。在植入的背側區域發現大量密集的GCaMP+胞體（圖6B），管腔內的軸突和樹突橫跨微柱（圖6D）。觀察到背側聚集體沿腦表面或沿微柱進一步擴散，推測是由于細胞從聚集體遷移而增加與宿主組織的相互作用（圖6B）。在某些情況下，從腹側植入物的位置也有高達數毫米的神經元遷移，盡管遷移的存在和程度因植入物而異。總的來說，在活體電極的腹側聚集體中有廣泛的神經突起生長，并有結構證據表明與宿主神經元形成突觸（圖6E和F）。箭頭表示穿透宿主大腦的十個神經突起和假定的突觸形成，虛線表示放大（F）。比例尺，100μm（A至C）、50μm（D和E）和10μm（F）。HST，Hochest。
圖3. μTENN免疫組化結果和Visikol組織透明化成像
簡便、高效的Visikol透明化方法
其中經采用振動切片的方式采集到的100-200um切片至2mm厚切片，均由Visikol透明化化，采用簡單的梯度脫水后，即可直接使用Visikol HISTO透明化試劑，2mm厚切片簡單浸泡4小時（Visikol HISTO-1、HISTO-2分別孵育2小時）即可成像，可解決由于組織光散射特性而限制對超過幾百微米深的神經元成像觀察問題。Visikol HISTO試劑專為生物大樣品透明化而設計，適用于厚度超過1mm的樣品，且不需要去除細胞膜脂質，因此保留了固有的細胞結構（親脂性染料適用），兼容免疫染色，此外透明化結果可逆，可繼續進行相關組學研究。
目前Visikol系列產品，不僅有用于完整動物組織的透明化試劑，還有可用于3D細胞培養模型透明化、動物胎兒骨成像、以及植物樣本透明化等樣本，適用的樣本種類多，可應對廣大科研工作者各類研究需求。目前Visikol透明化所有產品锘海均代理有售，歡迎垂詢！文末為Visikol透明化的小鼠卵巢樣本血管染色成像結果（內皮細胞抗體CD31特異性染色）。
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參考文獻
[1] Abdulkader, S. N. , Atia, A. , & Mostafa, M. S. M. . (2015). Brain computer interfacing: applications and challenges. Egyptian Informatics Journal, 16( 2), 213-230.
[2] Kawala-Sterniuk A, Browarska N, Al-Bakri A, et al. Summary of over Fifty Years with Brain-Computer Interfaces-A Review. Brain Sci. 2021;11(1):43.
[3] Grill WM, Norman SE, Bellamkonda RV. Implanted neural interfaces: biochallenges and engineered solutions. Annu Rev Biomed Eng. 2009;11:1-24.
[4] Kirsch RF, Ajiboye AB, Miller JP. The Reconnecting the Hand and Arm with Brain (ReHAB) Commentary on "An Integrated Brain-Machine Interface Platform With Thousands of Channels". J Med Internet Res. 2019;21(10):e16339.
[5] Martini ML, Oermann EK, Opie NL, Panov F, Oxley T, Yaeger K. Sensor Modalities for Brain-Computer Interface Technology: A Comprehensive Literature Review. Neurosurgery. 2020;86(2):E108-E117.
[6] Jeong YC, Lee HE, Shin A, Kim DG, Lee KJ, Kim D. Progress in Brain-Compatible Interfaces with Soft Nanomaterials. Adv Mater. 2020;32(35):e1907522.
[7] Adewole DO, Struzyna LA, Burrell JC, et al. Development of optically controlled "living electrodes" with long-projecting axon tracts for a synaptic brain-machine interface. Sci Adv. 2021;7(4):eaay5347.
[8] Tresco PA, Winslow BD. The challenge of integrating devices into the central nervous system. Crit Rev Biomed Eng. 2011;39(1):29-44.
[9] Harris JP, Tyler DJ. Biological, mechanical, and technological considerations affecting the longevity of intracortical electrode recordings. Crit Rev Biomed Eng. 2013;41(6):435-456.
[10] Woeppel K, Yang Q, Cui XT. Recent Advances in Neural Electrode-Tissue Interfaces. Curr Opin Biomed Eng. 2017;4:21-31.
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