文章簡介
大腦調控了不同的內部狀態，包括饑餓、焦慮和攻擊性，每一種狀態都會改變動物的行為。例如，一只饑餓的小鼠會四處走動尋找食物，而焦慮的小鼠會呆在原地，或者只是猶豫不決地探索周圍的環境，然而，編碼不同大腦狀態的神經元網絡仍不清楚。瑞士弗里德里希·米歇爾生物醫學研究所的Andreas Luthi研究組于2021年3月3日在Nature上發表了題為“State-dependent encoding of exploratory behaviour in the amygdala”的文章，研究人員通過Inscopix超微顯微成像發現，小鼠杏仁核中的兩大群神經元在探索環境和進行防御行為(如凍結)之間切換時，表現出了相反的活動模式——這一發現暗示了杏仁核在協調大腦狀態中的關鍵作用。

摘要
動物的行為是由新陳代謝、情感和社會因素所決定的。根據狀態的不同，動物會集中精力躲避威脅、尋找食物或進行社交互動，并顯示出適當的行為技能。此外，動物通過優先考慮適當的行為技能來適應環境變化的能力決定了動物的生存和繁殖。盡管這些狀態被認為與大腦系統的特定功能有關，但人們對其基本原理還知之甚少。眾所周知，杏仁核是大腦的一個區域，整合了情感、社會和代謝信息。通過Inscopix成像觀察到基底外側杏仁核通過兩個大型的、功能不相關的、表現出緩慢動態的合集來編碼探索行為。作者發現，根據刺激的顯著性，通過與穩定和分層的神經元成對的集合來編碼空間探索和社交探索。這些發現表明，基底外側杏仁核作為一個低維度的，但環境依賴的分層分類器，編碼依賴狀態的行為信息。這種編碼功能在健康和疾病的內部狀態的調節中有一個基本的作用。

創新點
在此項研究中，作者Lüthi使用Inscopix自由行為顯微成像方法對小鼠的深部腦區進行神經元成像采集，當小鼠參與空間或社交探索時，Inscopix成像記錄了基底外側杏仁核的神經元是如何調控社交探索行為的編碼。而且因為精神疾病伴隨著大腦狀態的改變，了解大腦如何在狀態之間切換可能有助于找出這些疾病的錯誤之處，并找出緩解功能失調行為的潛在策略。

實驗背景
人類的情緒狀態被認為是由大腦范圍內的神經環路調節的，歷史上被稱為“邊緣系統”。這個神經環路的關鍵節點之一是杏仁核，它是一個皮層下區域，與大腦的許多區域緊密相連。大量的文獻表明，杏仁核基底外側核(BLA)對于處理感覺輸入和環境因素后表現的情感價值具有重要作用。最近，有研究表明，BLA的主要神經元不僅對條件線索做出反應，還反映了由這些線索誘發的持續行為，以及自我調節的行為。這些先前的研究可能表明，BLA在定義動物的某一種狀態時，決定了大腦如何對感覺輸入或環境因素進行編碼，以及這些信息如何轉化為適當的行為策略。
具有明顯行為后果的最顯著的外部刺激之一是特異性的存在。對人類的研究已經確定，杏仁核是“社會大腦”的一個重要部分，它與編碼社會距離、處理面部情感和注視眼睛區域有關，而且在自閉癥障礙患者中，杏仁核是失調的，這與BLA在調節嚙齒動物社會行為中的作用一致，社會互動導致活動依賴的即時早期基因的誘導，而BLA的功能失活促進了社會互動，這表明BLA專門調節社會互動的厭惡方面。
 
實驗目的
BLA中神經元的大規模集合的活動與動物在探索和防御行為中的參與有關，問題是，BLA是否僅僅反映了動物與環境的互動(獨立于它與物體的相互作用)，還是它不同地編碼了行為環境。作者假設，如果BLA參與了一種狀態的調節，這種狀態反映了動物所處的環境，并與適當的行為系統相關聯，那么另一種動物的出現應該會對BLA代表探索行為的方式產生強烈的影響。
 
實驗方案設計
為了捕捉自然的社交行為，作者建立了一個行為范式，在實驗小鼠短期適應環境后，允許兩只自由行為的小鼠在一個中性環境中互動8-9分鐘。在直接從行為追蹤過程中提取的參數(圖1a)的基礎上，作者檢測到五種不同的社會行為：接近、發起互動、交互互動、逃避和攻擊，以及凍結狀態。凍結狀態是由非社會線索和社會線索引起的(分別占總時間的1.6±0.3%和2.5±0.4%;配對t檢驗，t18 = 1.9, P = 0.06, n = 19只小鼠)。作者使用術語“中性行為”來指代小鼠不參與任何這些行為，但正在探索環境或自我梳理的時間，這導致了兩個小鼠行為的連續表征(圖1b)。小鼠最初表現出較高的凍結水平，然后迅速下降，然后在整個實驗過程中保持在較低水平。小鼠在社交的前2分鐘中花費了22.0±3.5%的時間進行互動，隨后在社交的最后2分鐘下降到了11.8±1.8%(圖1d)。總的來說，小鼠表現出很少的攻擊行為，社會互動通常是相互發起的，往復的或引發的回避行為(圖1e)，這表明，自然的社交行為實驗條件下，社交互動具有積極和消極的價值。

作者使用Inscopix超微顯微鏡對BLA的神經元進行深腦成像，BLA的神經元使用GCaMP6f標記(圖2e, f)；在成像過程中，沒有影響小鼠的社交行為 (圖2g)。通過Inscopix成像發現BLA的神經元在社交探索過程中表現出明顯變化，并表現出高度多樣的活動模式(圖2)。
實驗結果
BLA神經元的群體活動與社交探索的關系
在社會互動過程中(圖3a)，單個神經元活動之間的絕對成對相關性普遍較低(0.1±0.004,n = 10只小鼠)；然而，在群體水平上，作者觀察到相關的活動模式在整個過程中隨著慢時間尺度的變化而變化，并被大型神經元系統所共享(圖3b)。作者使用與距離測量的相關性進行了無監督的k-means聚類，將整個神經元群體劃分為兩個空間混合的集群，其獨立于小鼠的行為。兩個集群的平均活動顯示出精確到秒的時間尺度上的，顯著的相關活動模式(相關性為-0.76±0.04)(圖3b)，小鼠的行為與這兩個集群的相對活動之間具有很強的對應關系。其中一組顯示在社交探索時期活動增加(包括接近、互動和回避行為；第二組在小鼠不參與社交探索行為的時期選擇性地表現出更強的活動(稱為“不參與社交探索”的集合)(圖3b-e)。社交探索整體的激活既不是特定于發起互動的小鼠的身份(發起的互動與回報的互動)，也不是特定于互動的價值(攻擊性與非攻擊性的互動)(圖3f)。這表明，社交探索整體的活動主要反映的不是效價，而是小鼠與它們的群體的參與。

社交探索時期的特定行為是否可能是BLA神經元激活的潛在驅動因素？
接下來，作者討論了社交探索時期的特定運動是否可能是整體激活的潛在驅動因素。在兩種組合高度相對激活的時期，小鼠的瞬時速度分布是相似的，社交探索組合對較低速度的偏差較小。因此，沒有檢測到瞬時速度和整體活動之間的相關性(10只小鼠中有8只)或相關性很弱。作者比較了兩個集合激活時間之間的場地空間覆蓋(通過空間占用圖熵估計)，也沒有顯著差異。綜上所述，社交探索整體的激活并不反映社交探索過程中運動的增加(或減少)。當作者將整個神經元群體劃分為三個整體時，作者找不到關于效價或特定的社交探索行為的信息。此外，與抑制相關的活動在神經元總數中所占比例很大，這表明社交探索是由大的神經元集合編碼的。
為了測試社交探索是否能從BLA的群體活動中準確解碼出來，作者訓練了一個線性解碼器來區分社交探索和中性行為(圖3g)。對數據進行訓練和測試時解碼器性能較高，對打亂或循環移位數據進行訓練和測試時解碼器性能下降(圖3h)。
為了評估社交探索神經元表征的穩定性和特異性，在第一次社交探索后三天，小鼠被暴露在不同的特異環境中(圖3i)。在第一次社交探索過程中檢測到的集合在第二次社交探索過程中穩健地捕捉到了社交探索行為，這表明社交探索表征在不同的時間內是穩定的，并且不隨刺激小鼠的身份而變化(圖3j)。因此，當作者在第2個社交探索階段直接定義集成時，大多數神經元在整個會話中有保持，而在兩個社交探索階段中簇成員不穩定的神經元與其集成平均活動的相關性更弱(圖3k，4a-c)。
在單神經元水平上，31.0±4.0%的神經元被社交探索行為調節，并且同樣分布在“社交探索”和“非社交探索”階段的激活之間(4d, e)，與神經元的整體隸屬度總體一致(4f)。在兩個社交探索階段中，單個神經元與社會行為的對應關系是穩定的(4g)。值得注意的是，一些被社交探索激活的神經元被特定行為不同地激活，這表明了在單神經元水平上對特定行為的更詳細的特征(4h)。
社交探索和空間探索是否由相同的神經集群編碼？
接下來，作者研究了社交探索和空間探索是否由相同的集群編碼，這可能反映了小鼠更普遍的探索狀態。作者比較了BLA在社交探索中和24h后在同一場所的空間探索期間的神經元群體活動，在空間探索期間，小鼠可以探索環境和一個靜止的物體(圖5a)。與之前的研究結果一致，空間探索期間的群體活動可以類似地用兩個大的、逆相關的、慢動力學的整體來描述(相關性為-0.77±0.04)(圖5b)，它們在不同的時間內是穩定的。其中的一群神經元，不僅在小鼠探索物體時，而且時探索整個環境(稱之為“空間探索”組)期間表現出更強的活動能力；當小鼠沒有進行任何探索行為(稱之為“無空間探索”集合)時，另外一群神經元顯示出選擇性的活動增加(圖5c)。由空間占用圖熵量化的區域范圍 (圖5c)，當空間探索群體激活時，區域范圍顯著高于無空間探索集成激活時(圖5d)。將自動行為描述與特定行為的手動評分相結合，作者發現，當空間探索群體處于活躍狀態時，就會出現直立或與對象互動等探索性行為，而另一群神經元的活動與自我行為(如梳理和凍結)或非探索性行為有較高的相關性，與小鼠在環景中的位置無關。
與重復的空間或社交探索的穩定性相比，在空間和社交探索實驗中，單個神經元活動和群體平均活動之間的相關性僅有微弱關系(圖5e，f)，神經元同時成為空間探索和社交探索組合群體的概率與機會沒有顯著差異(圖5e)。發現，在社交探索過程中檢測到的高度預測社交探索行為的神經元集合與空間探索行為無關，反之亦然(圖5g)。
空間探索行為是否以及如何在神經元群體水平上進行編碼？
在社交探索階段，當小鼠不參與社交探索時，它們表現出了典型的與空間探索相關的行為(比如直立)。因此，問題就產生了：在同種物種存在的情況下，空間探索行為是否以及如何在神經元群體水平上進行編碼。當小鼠不參與社交探索時，空間探索集群的激活與更大的環境覆蓋范圍不一致，這表明另一只小鼠的出現導致空間探索行為策略的改變(圖5h, i)。空間探索集群的激活與小鼠直立相關，而非空間探索群體的激活與梳理相關(圖5i)。然后，作者根據在空間探索階段的集群活動情況，將神經元分為社會性和非社會性探索集合。在小鼠不參與社交探索的時期，只有屬于非社交探索整體的亞群顯示出更高的關系，這些亞種群表現出了一致的空間探索編碼和自我中心行為，而與另一只小鼠的存在或不存在是無關的。
 
結論
綜上所述，這些數據表明了神經元重新分配以整合不同行為環境的潛在邏輯，即BLA優先考慮社交線索。此外，研究結果表明，BLA以一種與價效無關的方式編碼社交探索行為，通過兩個大型的、功能不相關的、表現出慢動力學的集群。這一結果與之前的基于BLA的神經元的多效價編碼的證據一致。逆相關整體的緩慢動態是特定于BLA，還是涉及調節注意力和學習的更大的腦神經網絡的普遍特性，仍有待探索。
社交探索和空間探索行為在BLA中表現出顯著的穩定性。基于之前的工作，無論是空間還是社交探索，會有同樣的BLA組合編碼。然而，研究結果表明，在一種探索行為中處于活躍狀態的神經元的隸屬度并不能預測其與另一種探索行為的關聯。與這個概念相一致的是，非常相似的運動行為——比如接近一個物體或一個小鼠——由正交的神經元集合表示。
然而，一個與社交探索無關的神經元子集在行為情境(即同種個體的存在或缺失)中持續編碼空間探索和自我行為。在另一只小鼠面前，同時屬于空間和社交探索集合的神經元對空間探索行為不感興趣，這一事實強烈表明，BLA神經元亞群對編碼不同類型探索行為的集合具有顯著依賴性和層次分配。
因為社交探索和空間探索的集合似乎是從BLA中相同的神經元群中隨機抽取的，所以行為場境特異性可能是由明顯的外部感覺線索或更高階的場境特異性輸入驅動的，至少在一定程度上是這樣。因此，社會線索的顯著性可以解釋神經元對社會和空間探索集合的層次分配。通過局部抑制性微環路處理和解析這些輸入，以及神經調節，可能有助于BLA整體的動態調節。
研究結果表明，在小鼠中，BLA作為一種低維、靈活并分層的分類器，編碼動物的狀態，如其作為外部世界的功能的探索行為的參與所定義。杏仁核——通過它與許多皮層的關聯，以及皮層下區域和神經調節的目標的廣泛連接——可以在更大的大腦系統中傳播狀態信號，從而協調和優先處理與環境相關的的感知、行動選擇和學習的大腦活動。


參考文獻
Maria Sol Fustinana, et al. State-dependent encoding of exploratory behaviour in the amygdala. Nature(2021)

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