隔日禁食 (ADF)是目前流行的熱量限制形式之一，已有動物及臨床研究顯示ADF可改善代謝健康，但其驅動機制尚不清楚。有研究發現ADF可能在胰島素敏感性方面具有重要作用，而肝臟在胰島素作用和血糖管理方面都發揮著至關重要的作用，其中與復雜的線粒體代謝密不可分。但肝臟線粒體是否參與或如何參與ADF介導的代謝益處尚不清楚。西安交通大學馮智輝/劉健康教授團隊等通過代謝組學等技術揭示肝臟在ADF介導的代謝益處的關鍵作用，并表明靶向肝臟線粒體復合物Ⅱ可能是對抗代謝紊亂的新策略，相關成果發表于《Advanced Science》。麥特繪譜提供代謝組學檢測服務。

1. ADF通過擾亂線粒體復合物Ⅱ組裝促進肝臟代謝重塑

本研究中，小鼠接受定期喂養或ADF干預4周，每4天監測一次體重和食物攝入量。ADF組小鼠在干預1周后體重增加減慢，而兩組之間食物攝入量相當。ADF組小鼠血清 ALT、AST、TC、TG、肌酐、尿素和空腹胰島素水平與對照組無顯著差異，而ADF組小鼠葡萄糖耐量和胰島素敏感性顯著提高。肝臟組織代謝組學研究發現47種代謝物在ADF和對照組之間存在顯著差異，這些變化主要與氨基酸代謝有關。

由于線粒體是將非必需氨基酸代謝與三羧酸（TCA）循環耦合的關鍵細胞器，隨后對線粒體展開相關研究。結果表明，在肝臟組織中，電子傳遞鏈 (ETC)五種復合物中只有線粒體復合物Ⅱ（又稱線粒體琥珀酸脫氫酶，SDH）活性在ADF組中顯著降低，而其在外周組織則無顯著差異。線粒體復合物Ⅱ四個亞基mRNA轉錄和蛋白表達水平無差異，且ADF也未改變其他線粒體復合物亞基mRNA轉錄水平。但是，ADF顯著改變線粒體復合物Ⅱ組裝因子——琥珀酸脫氫酶組裝因子 2 (SDHAF2) 和 SDHAF4蛋白質表達水平。其中，ADF不僅顯著降低了 SDHAF4蛋白表達水平，且導致SDHAF4與SDHB結合減少，從而破壞了SDHA與SDHB進一步結合。因此，ADF干預誘導線粒體復合物 Ⅱ 活性降低，主要原因為SDHAF4表達降低進而抑制線粒體復合物 Ⅱ的組裝（圖 1）。

圖1. ADF通過抑制線粒體復合物Ⅱ的組裝促進肝臟代謝重塑

2. 肝臟Sdhaf4敲除抑制線粒體復合物II，但不影響表型

構建肝臟特異性Sdhaf4基因敲除小鼠（Sdhaf4Alb KO）進一步探索肝臟SDHAF4介導的復合物Ⅱ功能障礙對代謝的影響。結果顯示，Sdhaf4敲除對小鼠血清ALT、AST、TC、TG水平無顯著影響。與ADF組小鼠一致，Sdhaf4Alb KO小鼠線粒體復合物亞基表達水平趨勢相似，SDH亞基SDHA和SDHB蛋白水平顯著降低，而復合物 ⅡI、IV和V活性降低不顯著。SDHA/SDHB結合和泛素修飾的免疫沉淀分析表明SDH蛋白水平降低歸因于泛素修飾增強和蛋白降解。

線粒體復合物 Ⅱ 活性降低會抑制線粒體三磷酸腺苷 (ATP)產生，結果表明，在Sdhaf4Alb KO小鼠和ADF組小鼠中，ATP產生減少。不過ATP產生減少并未影響AMPK、mTOR信號、線粒體自噬活性。HE染色結果表明， Sdhaf4Alb KO小鼠肝臟結構正常。電子顯微鏡顯示Sdhaf4Alb KO小鼠線粒體微觀結構和數量未改變，這表明，肝臟中SDHAF4的缺失會抑制線粒體活性，但不會引起劇烈的線粒體應激。Sdhaf4Alb KO小鼠表現出正常的能量代謝，包括總活動、O2消耗、CO2產生、熱量產生、食物攝入和呼吸交換。Sdhaf4Alb KO小鼠糞便成分和卡路里變化與對照組相似。對肝臟進行膽汁酸譜檢測，鵝去氧膽酸 (CDCA) 和 7-酮石膽酸 (7-Keto LCA)發生顯著改變。總之，肝臟中SDHAF4缺失對小鼠的能量吸收/利用無顯著影響（圖2）。

圖2. 肝臟Sdhaf4敲除破壞線粒體復合物，但不影響表型

3. Sdhaf4 敲除提高小鼠全身代謝敏感性

Sdhaf4Alb KO和對照小鼠之間血脂、空腹血糖和空腹胰島素水平保持相似。不過Sdhaf4Alb KO小鼠口服葡萄糖耐量和胰島素敏感性顯著改善，與ADF組一致。此外，KO小鼠在胰島素誘導后肝臟、肌肉（股四頭肌）和腹股溝白色脂肪組織（iWAT）中絲氨酸/蘇氨酸激酶（Akt）磷酸化顯著增加。通過轉染腺病毒來過表達肝臟Sdhaf4，結果表明，Sdhaf4過表達顯著恢復Sdhaf4Alb KO小鼠肝臟中的SDHA和SDHB蛋白水平，而不影響血清脂質水平。同時，過表達并未改變對照小鼠的葡萄糖和胰島素耐受性，但顯著降低Sdhaf4Alb KO小鼠的葡萄糖和胰島素耐受性。在恢復SDHAF4水平后，Sdhaf4Alb KO小鼠Akt 磷酸化也降低，進一步說明肝臟SDHAF4缺失對改善全身代謝能力的驅動作用。此外，對 Sdhaf4Alb KO小鼠進行長達12個月的觀察及小鼠肢體力量測試等分析，揭示對照組和Sdhaf4Alb KO小鼠在 2、6 和12個月齡存在相似變化，提示抑制肝臟線粒體復合物 Ⅱ 組裝可能是改善全身代謝益處安全有效的策略（圖 3）。

圖3. 肝臟 Sdhaf4 敲除提高小鼠的全身代謝敏感性

由于肝臟SDHAF4缺失改善了代謝能力，隨后評估對代謝應激的益處。在喂食高脂飲食（HFD）12 周后，Sdhaf4Alb KO小鼠表現出對 HFD誘導的體重增加的顯著抵抗，以及對WAT 增加的抵抗，肝臟、棕色脂肪組織 (BAT)、性腺 WAT (gWAT) 和 iWAT 的H&E染色結果進一步佐證。此外，HFD喂養下Sdhaf4Alb KO小鼠肝臟甘油三酯和總膽固醇水平顯著降低。Sdhaf4Alb KO小鼠在 HFD 喂養下仍表現出葡萄糖和胰島素耐受性顯著改善。同時，肝臟、肌肉和 iWAT 中胰島素刺激的 Akt 磷酸化顯著增加。這些結果表明Sdhaf4Alb KO小鼠在常規甚至HFD 環境下都保持較好的代謝敏感性（圖4）。

圖4. 肝臟中SDHAF4的缺失保護小鼠免受代謝壓力

4. 抑制線粒體復合物 Ⅱ 組裝可促進氨基酸代謝

在線粒體五種復合物中，復合物Ⅱ是唯一已知的同時參與 TCA 循環和電子傳遞鏈的復合物。SDHAF4缺失破壞了復合物Ⅱ的組裝，從而促進SDH亞基降解。因此，猜測Sdhaf4Alb KO小鼠肝臟TCA活性發生顯著抑制。將對照組和Sdhaf4Alb KO小鼠肝組織進行代謝組學研究，Sdhaf4Alb KO小鼠肝臟中氨基酸增多和碳水化合物降低。生化檢測和染色結果表明， Sdhaf4Alb KO小鼠糖原水平降低。糖原基因Pgc-1、FoxO1、Pck1和G6pc表達顯著降低，表明糖異生受到抑制，這可能是由于胰島素信號傳導增加所致。

SDHAF4缺失影響了TCA循環中的富馬酸和蘋果酸水平，且它們在 Sdhaf4Alb KO小鼠顯著增加，提示存在響應SDH功能障礙的補償通路。盡管 Sdhaf4Alb KO小鼠和ADF組小鼠ATP水平均降低，但NAD+和NADH均無顯著影響，表明盡管SDH活性受到抑制，Sdhaf4Alb KO小鼠和ADF組小鼠仍能實現功能性TCA循環。通路富集結果表明，氨基酸代謝是受影響最大的通路。已有研究報道精氨酸代謝與TCA循環密切相關。精氨酸由精氨酸琥珀酸合酶 (ASS) 和精氨酸琥珀酸裂解酶 (ASL) 生成，產生的副產物富馬酸轉化為蘋果酸進而生成草酰乙酸，用于生成天冬氨酸進入精氨酸合成循環。同時，精氨酸代謝為鳥氨酸和尿素，進行尿素循環。這些數據提示，抑制復合物 Ⅱ 組裝可以激活精氨酸生物合成通路以維持富馬酸水平，從而維持體內TCA代謝功能（圖 5）。

圖5. 抑制線粒體復合物 Ⅱ 組裝可促進氨基酸代謝

5. SDHAF4缺失激活精氨酸-NO循環以改善小鼠胰島素敏感性

肝臟SDHAF4缺失可以改善胰島素敏感性，這提示存在中間介質從肝臟釋放進入循環系統。血清代謝組學分析發現，精氨酸生物合成是Sdhaf4Alb KO小鼠中受影響的顯著通路，且瓜氨酸顯著增加。瓜氨酸是由一氧化氮合酶 (NOS) 催化產生，該反應還產生一氧化氮 (NO)，NO是多種生理過程中的關鍵調節劑，因此探究NO是否是調節代謝益處的關鍵效應物。結果表明，Sdhaf4Alb KO和ADF組小鼠血清NO水平均升高，肝臟中NOS1 和 NOS3 表達也顯著增加，而在其他組織中未觀察到這種變化，提示精氨酸-NO循環在Sdhaf4Alb KO和ADF組小鼠肝臟中被激活。通過飲用水添加NOS抑制劑(N-硝基-L-精氨酸甲酯，L-NAME) 來抑制Sdhaf4Alb KO和ADF組小鼠NO，結果顯示，L-NAME顯著消除葡萄糖耐量和胰島素相關的Akt 磷酸化。此外，L-NAME 也可消除Sdhaf4Alb KO小鼠對 HFD 誘導的代謝保護。

為探究肝臟代謝調節作用對肌肉和脂肪組織的影響，對原代肝細胞與小鼠 C2C12 肌管或 3T3-L1脂肪細胞進行共培養。與Sdhaf4Alb KO小鼠肝細胞共培養的 C2C12 或 3T3-L1 細胞中Akt磷酸化顯著增加。循環系統中的NO 是否作用于靶組織，分析結果顯示，Sdhaf4Alb KO小鼠和ADF組小鼠肝臟、肌肉和 iWAT 中NO下游因子cGMP（環磷鳥嘌呤核苷）顯著增加。而且，在有或無L-NAME處理的情況下，Sdhaf4Alb KO小鼠靶組織中cGMP 水平與NO水平變化一致。為闡述組織胰島素敏感性增強是NO直接作用，Sdhaf4Alb KO小鼠進行短期L-NAME干預，肝臟中NO的產生和血清中NO水平顯著抑制，且肝臟、脂肪和肌肉中胰島素信號改善被顯著抑制。這些數據提示，肝臟SDHAF4-精氨酸軸驅動NO產生并通過 cGMP 信號靶向外周組織以增強胰島素敏感性（圖 6）。

圖6. SDHAF4 的肝臟缺失激活精氨酸-NO循環以改善小鼠胰島素敏感性

6. 肝臟NOS3是循環NO變化的原因

由于實驗組小鼠肝臟中NOS1和NOS3均顯著增加，因此進一步確定NO來源。用3種NOS 抑制劑處理Sdhaf4Alb KO小鼠原代肝細胞共培養的 C2C12 肌管，結果顯示，NOS3抑制劑顯著抑制胰島素誘導的Akt磷酸化，表明NOS3介導的NO產生可能是Sdhaf4Alb KO或ADF組小鼠全身代謝改善的原因。隨后構建肝臟Nos3敲除小鼠，其肝臟中Nos3表達和血清中NO水平均降低50%。對Nos3敲除小鼠進行ADF干預，Nos3敲除小鼠中葡萄糖和胰島素耐受被抑制，胰島素誘導的Akt磷酸化降低。Sdhaf4Alb KO小鼠與Nos3敲除小鼠進行雜交的小鼠表現出Sdhaf4完全缺失和肝臟Nos3 50% 表達。與Sdhaf4Alb KO小鼠相比，雜交小鼠NO循環水平顯著降低。同時，Nos3敲低也顯著降低Sdhaf4Alb KO小鼠中Akt磷酸化水平，且顯著抑制Sdhaf4Alb KO小鼠的葡萄糖和胰島素耐受能力。這些數據表明，肝臟NOS3 影響NO循環水平，SDHAF4-精氨酸-NO軸是調節ADF介導的代謝益處的潛在機制（圖7）。

圖7. 肝臟NOS3是代謝改善小鼠循環NO的原因

7. 肝臟Sdhaf4過表達減弱ADF對胰島素敏感性的改善作用

構建肝臟Sdhaf4過表達小鼠，在ADF干預下，轉染過表達載體的小鼠的葡萄糖耐量和胰島素敏感性顯著降低，組裝因子和SDH亞基轉錄表達無影響。此外，Sdhaf4過表達顯著改善了ADF誘導的線粒體復合物 Ⅱ 活性和SDH亞基組裝。Nos1、Nos3、Slc7a1 表達和血清 NO 水平降低，表明肝臟精氨酸-NO循環未被激活。肝臟、肌肉和 iWAT 組織中Akt磷酸化降低，表明肝臟 Sdhaf4 過表達顯著抑制ADF干預小鼠全身胰島素敏感性的提高。這些數據揭示了肝臟中高度動態和互作的線粒體代謝網絡，表明抑制肝臟復合物 Ⅱ 組裝可能是改善代謝能力的潛在策略（圖8）。

圖8. 肝臟Sdhaf4過表達減弱ADF小鼠對胰島素敏感性的改善

小結

本研究揭示肝臟在ADF干預期間經歷了顯著的代謝重編程，主要通過抑制組裝因子SDHAF4進而抑制線粒體復合物 Ⅱ 組裝。機制上，肝細胞激活精氨酸– NO軸以響應線粒體復合物Ⅱ和TCA循環，釋放NO增強多組織胰島素敏感性。這些結果突出了肝臟在ADF相關全身益處中的關鍵作用，并表明靶向肝臟線粒體復合物 Ⅱ 組裝可能是對抗代謝紊亂的新策略。

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參考文獻

Hepatic Suppression of Mitochondrial Complex Ⅱ Assembly Drives Systemic Metabolic Benefits. Advanced Science. 2022. https://doi.org/ 10.1002/advs.202105587.

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