摘要：建立了玉米的一步法提取6類真菌毒素同時檢測的分析方法，共分析了96份玉米中6類真菌毒素的污染情況及地域分布情況，為監測飼料質量提供技術指導。稱取的樣品添加6類真菌毒素同位素內標，以84%乙腈水和50%甲醇水作為提取試劑，以2mM乙酸銨0.1%甲酸水溶液和甲醇/乙腈和水為流動相梯度洗脫，采用液相色譜-串聯質譜進行檢測。94份玉米中6類真菌毒素的檢出率為98%，單種毒素檢出率最高的是伏馬毒素B1和B2，高達88%，嘔吐毒素和赭曲霉毒素A檢出率最低，均未檢出。伏馬毒素B1和B2、黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和嘔吐毒素的最高殘留量分別是89.1mg/kg、76.4ug/kg、3.95×103mg/kg和7.0mg/kg。地域分布上具有分布范圍廣，污染較嚴重的特點。建立的6類真菌毒素檢測方法操作簡單、結果準確，結果分析對玉米中真菌毒素污染檢測和防控具有重要意義。

關鍵詞：真菌毒素、液相色譜--串聯質譜、污染情況、真菌毒素同位素內標
真菌毒素屬于真菌的代謝產物，幾乎可以污染所有的農作物，會損害動物體的肝臟、腎臟及皮膚組織等，進而通過食物鏈的形式影響到人體的健康。[1]已知的真菌毒素多達300種以上，目前多個國家均建立了飼料中真菌毒素的限量要求，[2-3]我國已于2017年推出國家強制性標準GB 13078-2017飼料衛生標準，并于2018年實施，其對黃曲霉毒素B1、嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、伏馬毒素B1和B2、T-2毒素等做出明確的檢測方法規定和限量要求。本文采用94份玉米為樣本，對這6類真菌毒素進行檢測方法開發和污染情況分析。為多毒素的快速檢測提供技術支持的同時，也為飼料中真菌毒素污染的監測和防控提供幫助。本文采用液相色譜-串聯質譜，通過加入同位素內標進行校正的手段，開發6類真菌毒素的檢測方法，并對94份玉米樣品進行6類真菌毒素的檢測及污染情況分析。

1 材料
1.1儀器
TSQ Quantis液相色譜-串聯質譜、KS-7200DE超聲波提取儀和TGL-16M高速冷凍離心機1.2試劑 真菌毒素標準品：黃曲霉毒素B1（貨號：STD#1052）、嘔吐毒素（貨號：STD#3102）、玉米赤霉烯酮（貨號：STD#4012）、赭曲霉毒素A（貨號：STD#5012）、伏馬毒素B1和B2（貨號：STD#2013）和T-2毒素（貨號：STD#3111）
真菌毒素同位素內標：黃曲霉毒素B1同位素內標（貨號：STD#1041U）、嘔吐毒素同位素內標（貨號：STD#3101U）、玉米赤霉烯酮同位素內標（貨號：STD#4010U）、赭曲霉毒素A同位素內標（貨號：STD#5010U）、伏馬毒素B1同位素內標（貨號：STD#2030U）、伏馬毒素B2同位素內標（貨號：STD#2040U）和T-2毒素同位素內標（貨號：STD#3110U）
1.3樣品 
96份玉米種類及地域分布（樣品來源于全國近30個省份及地區）
96份玉米種類涉及青農1801、鄭單958、萬盛189、登海W189、洛玉16、中選777等。依據我國區域劃分方式將94份玉米的分布區域進行匯總統計

2 方法

2.1色譜及質譜條件：

色譜柱： Hypersil GOLD C18 （100*2.1 3um）

流動相： 2mM乙酸銨0.1%甲酸水溶液和甲醇梯度洗脫伏馬毒素B1和B2、黃曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A和T-2毒素/乙腈水梯度洗脫嘔吐毒素和玉米赤霉烯酮

梯度表1

梯度表2

采用ESI離子源，分別用正離子模式掃描和負離子模式掃描，多反應監測模式（MRM）采集數據，6類真菌毒素及其對應同位素內標的質譜參數見下表：
6類真菌毒素及其對應同位素內標的質譜參數

注：FB1為伏馬毒素B1簡寫（下同），FB2為伏馬毒素B2簡寫，AFB1為黃曲霉毒素B1簡寫，OTA為赭曲霉毒素A簡寫，T-2位T-2毒素簡寫，DON為嘔吐毒素簡寫，ZON為玉米赤霉烯酮簡寫；13C為其相應的同位素內標簡寫
2.2標準品的配制 
2.2.1混合標準品配制：配制伏馬毒素B1和B2濃度為2.4ppm、黃曲霉毒素B1濃度為80ppb、玉米赤霉烯酮1.6ppm、嘔吐毒素3.2ppm、T-2毒素1.6ppm、OTA160ppb的混標
2.2.2同位素內標配制：配制伏馬毒素B1和B2濃度為240ppb、黃曲霉毒素B1濃度為8ppb、玉米赤霉烯酮160ppb、嘔吐毒素320ppb、T-2毒素160ppb、OTA16ppb的同位素內標混合標準品
2.3樣品處理
稱取5g樣品各兩份，加入同位素內標100uL，其中一份加入20mL84%乙腈水，另一份加入20mL50%甲醇水，超聲波震蕩提取20min，6000r/min離心5min，上清液過0.22um有機濾膜，液相色譜-串聯質譜檢測。

3.結果分析
3.1譜圖

FB1、FB2、AFB1、OTA和T-2的外標及同位素內標的MRM圖
 

DON和ZON的外標及同位素內標的MRM圖

3.2回收率

3.3線性

3.4整體污染情況
對96份玉米的6類真菌毒素檢測結果進行分析匯總，所有樣品均未檢出赭曲霉毒素和T-2毒素。96份玉米中有2份玉米不含有這6類真菌毒素，10份玉米只含有1類真菌毒素，32份玉米含有2類真菌毒素，44份玉米含有3類真菌毒素，6份玉米含有4類真菌毒素。

污染情況占比圖

3.5區域分布情況
依據94份樣品分布區域進行劃分，對6種真菌毒素進行分析匯總（匯總表見下），西北地區玉米受真菌毒素污染的種類最少，污染程度最低；華中地區、華北地區、西南地區和東北地區毒素污染情況較重；華東地區和華南地區玉米受真菌毒素污染的種類和程度最高。

3.6超限情況
3.6.1
對96份玉米的6類真菌毒素檢測結果進行分析匯總，依據GB 13078-2017 飼料衛生標準限量要求進行超限判斷（表1），超限樣品共計14份，其中9份樣品一類真菌毒素超限，剩余5份樣品兩類真菌毒素超限。針對赭曲霉毒素和T-2毒素含量，所有樣品均合格；此外，其余毒素超限情況如下：伏馬毒素B1+B2、黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素的超限樣品份數分別為：3份、2份、11份和3份，其對應的超限率分別為3.2%、2.1%、11.7%和3.2%。

表1 部分飼料原料中6類真菌毒素檢測標準及限量要求

3.6.2
對96份玉米的6類真菌毒素檢測結果進行分析匯總，依據GB 2761-2017 食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量要求進行超限判斷（表2），超限樣品共計46份，其中25份樣品一類真菌毒素超限，剩余21份樣品兩類真菌毒素超限。針對赭曲霉毒素含量，所有樣品均合格；此外，其余毒素超限情況如下：黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素的超限樣品份數分別為：4份、35份和28份，其對應的超限率分別為4.3%、37.2%和29.8%。

表2 部分食品中6類真菌毒素檢測標準及限量要求

3.7 單類毒素分析
由于所有樣品均未檢出赭曲霉毒素和T-2毒素，故只對其余四類真菌毒素進行單獨分析94份玉米中6類毒素污染情況對比圖

3.7.1 伏馬毒素B1+B2
對96份玉米的伏馬毒素B1和B2檢測結果進行分析匯總，有檢出樣品數量為88份，占比93.6%，檢測結果在0.0503mg/kg-89.1mg/kg，中位值為6.41mg/kg；整體污染水平為10.9mg/kg，陽性污染水平為11.6mg/kg。
3.7.2 黃曲霉毒素B1
對96份玉米的黃曲霉毒素B1檢測結果進行分析匯總，有檢出樣品數量為29份，占比30.9%，檢測結果在2.20ug/kg-76.4ug/kg，中位值為4.58ug/kg；整體污染水平為3.48ug/kg，陽性污染水平為11.3ug/kg。
3.7.3 玉米赤霉烯酮
對96份玉米的玉米赤霉烯酮檢測結果進行分析匯總，有檢出樣品數量為56份，占比59.6%，檢測結果在10.6mg/kg-3.95×103mg/kg，中位值為98.3mg/kg；整體污染水平為329mg/kg，陽性污染水平為552mg/kg。
3.7.4 嘔吐毒素
對96份玉米的嘔吐毒素檢測結果進行分析匯總，有檢出樣品數量為56份，占比59.6%，檢測結果在0.1mg/kg-7.0mg/kg，中位值為1.0mg/kg；整體污染水平為0.8mg/kg，陽性污染水平為1.4mg/kg。
4討論
目前，從技術角度講，飼料中真菌毒素檢測共涉及到6大類，檢測標準4項，前處理方法不一，凈化產品各異，對人員、操作、設備要求苛刻，給檢測帶來嚴峻的挑戰；從污染根源分析，一種真菌可能產生多種毒素，一種原料會受到多種真菌感染，往往是單個飼料樣品需要檢測多種真菌毒素；從現實情況來看，飼料受真菌毒素污染情況較嚴重，且分布不均勻，需要加強其毒素監測。本文所述的一步法檢測，采用直提的方式，同位素校正的手段，在保證結果準確的前提下，最大程度降低操作難度，縮短檢測周期，同時也控制了實驗成本。
綜上，本文不僅為飼料中6類真菌毒素的檢測提供有效的方法支撐，同時也為飼料中真菌毒素殘留的檢測方向提供指導，為保證飼料產品的質量提供幫助。

[1]王艷霞 飼料及原料中真菌毒素的危害、降解和檢測技術研究[J].飼料研究,NO.08 2022：158.

[2]孫梅峰,豆小文,張磊,等.真菌毒素毒性及其在生物樣本中檢測技術研 究進展[J].中國藥理學與毒理學雜志,2020,34(10):788-800.

[3]張徽,孫金旺,劉媛,等.農產品真菌毒素污染生物控制關鍵技術創新與 綜述 NO.08 2022 160 飼料研究 FEED RESEARCH 應用[J].中國科技成果,2020(3):69-70