摘要：建立了玉米的一步法提取6類真菌毒素同時檢測的分析方法，共分析了96份玉米中6類真菌毒素的污染情況及地域分布情況，為監測飼料質量提供技術指導。稱取的樣品添加6類真菌毒素同位素內標，以84%乙腈水和50%甲醇水作為提取試劑，以2mM乙酸銨0.1%甲酸水溶液和甲醇/乙腈和水為流動相梯度洗脫，采用液相色譜-串聯質譜進行檢測。94份玉米中6類真菌毒素的檢出率為98%，單種毒素檢出率最高的是伏馬毒素B1和B2，高達88%，嘔吐毒素和赭曲霉毒素A檢出率最低，均未檢出。伏馬毒素B1和B2、黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和嘔吐毒素的最高殘留量分別是89.1mg/kg、76.4ug/kg、3.95×103mg/kg和7.0mg/kg。地域分布上具有分布范圍廣，污染較嚴重的特點。建立的6類真菌毒素檢測方法操作簡單、結果準確，結果分析對玉米中真菌毒素污染檢測和防控具有重要意義。
關鍵詞：真菌毒素、液相色譜--串聯質譜、污染情況、真菌毒素同位素內標
 
  真菌毒素屬于真菌的代謝產物，幾乎可以污染所有的農作物，會損害動物體的肝臟、腎臟及皮膚組織等，進而通過食物鏈的形式影響到人體的健康。[1]已知的真菌毒素多達300種以上，目前多個國家均建立了飼料中真菌毒素的限量要求，[2-3]我國已于2017年推出國家強制性標準GB 13078-2017飼料衛生標準，并于2018年實施，其對黃曲霉毒素B1、嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、伏馬毒素B1和B2、T-2毒素等做出明確的檢測方法規定和限量要求。本文采用94份玉米為樣本，對這6類真菌毒素進行檢測方法開發和污染情況分析。為多毒素的快速檢測提供技術支持的同時，也為飼料中真菌毒素污染的監測和防控提供幫助。本文采用液相色譜-串聯質譜，通過加入同位素內標進行校正的手段，開發6類真菌毒素的檢測方法，并對94份玉米樣品進行6類真菌毒素的檢測及污染情況分析。
 
1.材料
 
1.1儀器 TSQ Quantis液相色譜-串聯質譜、KS-7200DE超聲波提取儀和TGL-16M高速冷凍離心機
 
1.2試劑 真菌毒素標準品：黃曲霉毒素B1、嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、伏馬毒素B1和B2和T-2毒素
 
真菌毒素同位素內標：黃曲霉毒素B1同位素內標、嘔吐毒素同位素內標、玉米赤霉烯酮同位素內標、赭曲霉毒素A同位素內標、伏馬毒素B1同位素內標、伏馬毒素B2同位素內標和T-2毒素同位素內標
 
1.3樣品 
96份玉米種類及地域分布（樣品來源于全國近30個省份及地區）
 
96份玉米種類涉及青農1801、鄭單958、萬盛189、登海W189、洛玉16、中選777等。依據我國區域劃分方式將94份玉米的分布區域進行匯總統計

區域	省份	份數
華東地區	山東、江蘇、安徽、浙江、福建、上海	22
華南地區	廣東、廣西、海南	10
華中地區	湖南、湖北、河南、江西	12
華北地區	北京、天津、河北、山西、內蒙古	17
西南地區	四川、云南、西藏、重慶	12
西北地區	寧夏、新疆、青海、陜西、甘肅	10
東北地區	黑龍江、吉林、遼寧	11

2.方法
2.1色譜及質譜條件：
色譜柱： Hypersil GOLD C18 （100*2.1 3um）
流動相： 2mM乙酸銨0.1%甲酸水溶液和甲醇梯度洗脫伏馬毒素B1和B2、黃曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A和T-2毒素/乙腈水梯度洗脫嘔吐毒素和玉米赤霉烯酮
梯度表1

時間	流速mL/min	2mM乙酸銨0.1%甲酸水	甲醇
0	0.3	70	30
1	0.3	70	30
3.5	0.3	30	70
4	0.3	30	70
5	0.3	5	95
9	0.3	5	95
10	0.3	70	30

梯度表2

時間	流速mL/min	水	乙腈
0	0.3	70	30
1	0.3	70	30
3.5	0.3	30	70
4	0.3	30	70
5	0.3	5	95
9	0.3	5	95
10	0.3	30	70

 
采用ESI離子源，分別用正離子模式掃描和負離子模式掃描，多反應監測模式（MRM）采集數據，6類真菌毒素及其對應同位素內標的質譜參數見下表：
 
6類真菌毒素及其對應同位素內標的質譜參數

毒素名稱	母離子m/z	子離子m/z	碰撞電壓/V	射頻透鏡 電壓/V	采集模式
FB1	722.3	334/352	40/36	279	[M+H]+
13C-FB1	756	356/373/374/737	39/34/35/26	180	[M+H]+
FB2	706.35	318/336	35/39	243	[M+H]+
13C-FB2	740.7	340/358/376/723	40/38/34/28	216	[M+H]+
AFB1	313.1	241/269/285	38/32/23	176	[M+H]+
13C-AFB1	330	255/284/301	39.7/32.8/24.1	181	[M+H]+
OTA	404.088	193/221/239/241/358	43/37/24/20/15	143	[M+H]+
13C-OTA	424	250/377	27/14	140	[M+H]+
T-2	484.21	185/215/305	22/19/13	109	[M+NH4]+

 

毒素名稱	母離子m/z	子離子m/z	碰撞電壓/V	射頻透鏡電壓/V	采集模式
13C-T-2	508.4	198/229/322	22/19/14	121	[M+NH4]+
DON	295	138/265	17/12	109	[M-H]-
13C-DON	310	145/279	14/12	109	[M-H]-
ZON	317	131/175/273	30/24/19	170	[M-H]-
13C-ZON	335	140/185/290	31/25/19	178	[M-H]-

 
注：FB1為伏馬毒素B1簡寫（下同），FB2為伏馬毒素B2簡寫，AFB1為黃曲霉毒素B1簡寫，OTA為赭曲霉毒素A簡寫，T-2位T-2毒素簡寫，DON為嘔吐毒素簡寫，ZON為玉米赤霉烯酮簡寫；13C為其相應的同位素內標簡寫
 
2.2標準品的配制 
 
2.2.1混合標準品配制：配制伏馬毒素B1和B2濃度為2.4ppm、黃曲霉毒素B1濃度為80ppb、玉米赤霉烯酮1.6ppm、嘔吐毒素3.2ppm、T-2毒素1.6ppm、OTA160ppb的混標
 
2.2.2同位素內標配制：配制伏馬毒素B1和B2濃度為240ppb、黃曲霉毒素B1濃度為8ppb、玉米赤霉烯酮160ppb、嘔吐毒素320ppb、T-2毒素160ppb、OTA16ppb的同位素內標混合標準品
 
2.3樣品處理
 
稱取5g樣品各兩份，加入同位素內標100uL，其中一份加入20mL84%乙腈水，另一份加入20mL50%甲醇水，超聲波震蕩提取20min，6000r/min離心5min，上清液過0.22um有機濾膜，液相色譜-串聯質譜檢測。
 
3.結果分析
3.1譜圖 3.2回收率

項目	FB1	FB2	AFB1	ZON	DON	T-2	OTA
添加水平	600ng/g	600ng/g	20ng/g	400ng/g	800ng/g	400ng/g	40ng/g
回收率	83.6%	80.4%	101.8%	109.8%	88.0%	91.3%	86.9%

 
3.3線性

項目	相關系數	線性范圍/ng	線性方程
FB1	0.9991	0.19-100	y = 219.68x - 1206.9
FB2	0.9996	0.19-100	y = 911.45x - 1989.7
AFB1	0.9993	0.049-40	y = 61482x + 6.8125
ZON	0.9995	0.094-35	y = 8008.3x - 42517
DON	0.9999	2-450	y = 2755.5x - 796.14
T-2	0.9994	0.1-100	y = 110254x - 63112
OTA	0.9997	0.01-20	y = 1824.1x + 1.5954

 
3.4整體污染情況
 
對96份玉米的6類真菌毒素檢測結果進行分析匯總，所有樣品均未檢出赭曲霉毒素和T-2毒素。96份玉米中有2份玉米不含有這6類真菌毒素，10份玉米只含有1類真菌毒素，32份玉米含有2類真菌毒素，44份玉米含有3類真菌毒素，6份玉米含有4類真菌毒素。
 
污染情況占比圖  
 
3.5區域分布情況
 
依據94份樣品分布區域進行劃分，對6種真菌毒素進行分析匯總（匯總表見下），西北地區玉米受真菌毒素污染的種類最少，污染程度最低；華中地區、華北地區、西南地區和東北地區毒素污染情況較重；華東地區和華南地區玉米受真菌毒素污染的種類和程度最高。
 

毒素種類	華東	華南	華中	華北	西南	西北	東北	總計
0	0	0	0	0	0	2	0	2
1	2	0	0	1	1	5	1	10
2	6	2	6	7	4	1	6	32
3	13	5	6	9	5	2	4	44
4	1	3	0	0	2	0	0	6
5	0	0	0	0	0	0	0	0
6	0	0	0	0	0	0	0	0
總計	22	10	12	17	12	10	11	94

 
3.6超限情況
3.6.1
對96份玉米的6類真菌毒素檢測結果進行分析匯總，依據GB 13078-2017 飼料衛生標準限量要求進行超限判斷（表1），超限樣品共計14份，其中9份樣品一類真菌毒素超限，剩余5份樣品兩類真菌毒素超限。針對赭曲霉毒素和T-2毒素含量，所有樣品均合格；此外，其余毒素超限情況如下：伏馬毒素B1+B2、黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素的超限樣品份數分別為：3份、2份、11份和3份，其對應的超限率分別為3.2%、2.1%、11.7%和3.2%。
 
表1 部分飼料原料中6類真菌毒素檢測標準及限量要求

項目	產品名稱	檢測標準	限量
黃曲霉毒素B1	玉米加工產品、花生餅	NY/T 2071	≤50ug/kg
赭曲霉毒素A	谷物及其加工產品	GB/T 30957	≤100ug/kg
玉米赤霉烯酮	玉米及其加工產品	NY/T 2071	≤0.5mg/kg
嘔吐毒素	植物性飼料原料	GB/T 30956	≤5mg/kg
T-2毒素	植物性飼料原料	NY/T 2071	≤0.5mg/kg
伏馬毒素B1+2	玉米及其加工產品	NY/T 1970	≤60mg/kg

3.6.2
對96份玉米的6類真菌毒素檢測結果進行分析匯總，依據GB 2761-2017 食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量要求進行超限判斷（表2），超限樣品共計46份，其中25份樣品一類真菌毒素超限，剩余21份樣品兩類真菌毒素超限。針對赭曲霉毒素含量，所有樣品均合格；此外，其余毒素超限情況如下：黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素的超限樣品份數分別為：4份、35份和28份，其對應的超限率分別為4.3%、37.2%和29.8%。
 
表2 部分食品中6類真菌毒素檢測標準及限量要求

項目	食品類別	檢驗方法	限量
黃曲霉毒素B1	玉米、玉米面及玉米制品	GB 5009.22	20ug/kg
赭曲霉毒素A	谷物及其制品	GB 5009.96	5.0ug/kg
玉米赤霉烯酮	玉米、玉米面（渣、片）	GB 5009.209	60ug/kg
嘔吐毒素	玉米、玉米面（渣、片）	GB 5009.111	1000ug/kg

 
 
3.7 單類毒素分析
 
由于所有樣品均未檢出赭曲霉毒素和T-2毒素，故只對其余四類真菌毒素進行單獨分析94份玉米中6類毒素污染情況對比圖
   
3.7.1 伏馬毒素B1+B2
對96份玉米的伏馬毒素B1和B2檢測結果進行分析匯總，有檢出樣品數量為88份，占比93.6%，檢測結果在0.0503mg/kg-89.1mg/kg，中位值為6.41mg/kg；整體污染水平為10.9mg/kg，陽性污染水平為11.6mg/kg。
 
3.7.2 黃曲霉毒素B1
對96份玉米的黃曲霉毒素B1檢測結果進行分析匯總，有檢出樣品數量為29份，占比30.9%，檢測結果在2.20ug/kg-76.4ug/kg，中位值為4.58ug/kg；整體污染水平為3.48ug/kg，陽性污染水平為11.3ug/kg。
 
3.7.3 玉米赤霉烯酮
對96份玉米的玉米赤霉烯酮檢測結果進行分析匯總，有檢出樣品數量為56份，占比59.6%，檢測結果在10.6mg/kg-3.95×103mg/kg，中位值為98.3mg/kg；整體污染水平為329mg/kg，陽性污染水平為552mg/kg。
 
3.7.4 嘔吐毒素
對96份玉米的嘔吐毒素檢測結果進行分析匯總，有檢出樣品數量為56份，占比59.6%，檢測結果在0.1mg/kg-7.0mg/kg，中位值為1.0mg/kg；整體污染水平為0.8mg/kg，陽性污染水平為1.4mg/kg。
 
4討論
目前，從技術角度講，飼料中真菌毒素檢測共涉及到6大類，檢測標準4項，前處理方法不一，凈化產品各異，對人員、操作、設備要求苛刻，給檢測帶來嚴峻的挑戰；從污染根源分析，一種真菌可能產生多種毒素，一種原料會受到多種真菌感染，往往是單個飼料樣品需要檢測多種真菌毒素；從現實情況來看，飼料受真菌毒素污染情況較嚴重，且分布不均勻，需要加強其毒素監測。本文所述的一步法檢測，采用直提的方式，同位素校正的手段，在保證結果準確的前提下，最大程度降低操作難度，縮短檢測周期，同時也控制了實驗成本。
綜上，本文不僅為飼料中6類真菌毒素的檢測提供有效的方法支撐，同時也為飼料中真菌毒素殘留的檢測方向提供指導，為保證飼料產品的質量提供幫助。
 
 
[1]王艷霞 飼料及原料中真菌毒素的危害、降解和檢測技術研究[J].飼料研究,NO.08 2022：158.
[2]孫梅峰,豆小文,張磊,等.真菌毒素毒性及其在生物樣本中檢測技術研 究進展[J].中國藥理學與毒理學雜志,2020,34(10):788-800.
[3]張徽,孫金旺,劉媛,等.農產品真菌毒素污染生物控制關鍵技術創新與 綜述 NO.08 2022 160 飼料研究 FEED RESEARCH 應用[J].中國科技成果,2020(3):69-70