Nature|DNA甲基化測序助力人多能干細胞向胚胎全能8細胞的人工誘導
北京時間2022年3月22日凌晨，《Nature》期刊在線刊登了由中國科學院廣州生物醫學與健康研究所等單位牽頭，深圳市易基因科技有限公司、中國科學技術大學等單位參與，應用人多能干細胞向胚胎8細胞狀態人工誘導的科研成果。深圳市易基因科技有限公司運用簡化基因組甲基化測序、單細胞和微量細胞基因組DNA甲基化測序等技術，完成了研究中不同人工干預及細胞狀態下的基因組DNA甲基化的時空動態變化。
圖源Nature官網
論文中，研究者設計了一種非轉基因、快速、可控的“細胞重編程”方法，將人的多能干細胞轉化為全能性的8細胞期胚胎樣細胞，重編程形成的8CLC在轉錄和表觀遺傳修飾上與人類8細胞胚胎十分類似。
首先，研究者通過人類胚胎干細胞(ESC)篩選了針對信號轉導和表觀遺傳途徑的抑制劑，以逐漸確定產生8CLC的允許培養條件。在第一輪中，研究者將MEK抑制劑PD0325901 (PD)，tankyrase抑制劑IWR1和人LIF跟化學培養基結合，獲得具有原始多能干細胞樣克隆形態和基因表達的人多能干細胞(圖1)。在第二輪中，研究者結合這種基礎培養基，測試了14種額外的添加成分，其中組蛋白H3K27甲基化轉移酶EZH2抑制劑DZNep和I類組蛋白去乙酰化酶HDAC抑制劑TSA的添加，顯著提升多潛能相關基因的表達。轉化過程經過約12天(3代)，無明顯細胞死亡(圖1)。 研究者將這種原始培養基命名為4CL(4種化學物質+ LIF)，并在多個雄性和雌性ESC和iPSC細胞系中驗證了它的有效性，觀察到達15代沒有明顯核型異常的干細胞維持。
研究者進一步觀察4CL中TSA和DZNep劑量的增加對原始多能干細胞的影響。結果發現， 5天后，這種增強的4CL培養基(e4CL)促進了TPRX1、ZSCAN4、ZSCAN5B、DUXA/B和ZNF280A等全能性基因的表達，這些基因在不同的原始培養基中，在PSC細胞中表達量較低，尤其是在擴展多能干細胞中(expanded pluripotent stem cells, EPSC)。
在e4CL培養基中，細胞的核型保持正常，但不能傳代進行擴增培養，這可能與全能性細胞缺乏自我更新能力有關。 始發態細胞在e4CL中直接培養7天也可以激活全能性基因(圖1)，這種方法稱為直接e4CL（direct e4CL），以區別于階梯式的，首先是4CL，然后是e4CL轉化(階梯式e4CL)。
圖1始發態PSC在4CL、階梯e4CL和直接e4CL培養基形成naïve PSC和8CLC的示意圖
DNA甲基化是基因表達的重要調控因子，在早期胚胎發育、始發態向原始態多能干細胞轉化過程中，DNA甲基化將發生顯著動態改變。已有研究報道，人工誘導過程DNA大范圍的去甲基化與基因組穩定性的風險增加密切相關。研究者通過與胚胎發育8細胞DNA甲基化對比，探究e4CL培養基用于8CLC細胞轉化過程中，原始多能和全能性基因的甲基化變化情況。
首先，對始發態PSC、4CL 12天培養的原始態PSC和進一步e4CL 5天培養，以及直接e4CL 7天培養的細胞進行簡化基因組甲基化測序。結果顯示4CL 12天培養的原始態PSC甲基化水平比始發態PSC甲基化水平更低（圖2a），且與各種已發表的誘導技術相比，4CL 12天培養的原始態PSC基因組印跡位點與胚胎內細胞團 (ICM) 相似性程度更高（圖2b） 。直接e4CL 7天培養細胞甲基化水平與胚胎8細胞甲基化水平相似（圖2a）。
圖2、簡化基因組甲基化對不同培養條件細胞整體甲基化檢測（a）及印記基因CG甲基化檢測（b）.
此外，通過對8CLC細胞，4CL 12天培養原始PSC細胞以及始發態PSC細胞進行全基因組單/微量細胞甲基化測序，結果顯示，8CLC甲基化水平比4CL 12天培養的原始PSC或始發態PSC細胞甲基化水平更低，跟8細胞胚胎甲基化水平相當（圖3a）。轉錄起始位點、gene bodies和特定基因元件（如增強子、CG島、LTR、SINE、LINE、intergenic和intragenic等），8CLC甲基化水平也同樣比4CL 12天培養的原始PSC或始發態PSC細胞甲基化水平低（圖3b，c）。
圖3、始發態PSC、4CL和8CLC微量/單細胞全基因組甲基化測序甲基化水平分析
無論是簡化基因組甲基化測序結果還是微量細胞全基因組甲基化測序，原始多潛能基因和全能基因甲基化水平都保持相對一致水平(圖4)。
圖4、全基因組甲基化測序分析原始多潛能基因（藍色）和全能基因（紅色）甲基化狀態改變
為進一步探索8CLC細胞形成分子機制，研究者分析了不同細胞狀態的基因表達差異，發現449個基因表達在8CLC中上調，幾乎無下調基因。其中DPPA3和TPRX1基因處于上調前五基因內。已知DPPA3與UHRF1及DNMT1作用，控制小鼠卵母細胞被動去甲基化過程。DPPA3也通過調控印記基因甲基化修飾，參與到小鼠體細胞重編程過程。作者敲除DPPA3基因阻斷了始發態PSC細胞向原始態PSC細胞的轉化。敲除TPRX1基因阻斷了階段式e4CL和直接e4CL誘導8細胞胚胎標志物的形成，但是對4CL 12天培養原始態PSC的形成影響不大。與上述結果相對應，DPPA3基因敲除后，4CL 12天和e4CL 直接7天細胞基因組DNA甲基化整體升高（圖5a）。DPPA5和KHDC3L等原始多潛能基因，以及TPRX1和TRIM43等全能基因轉錄起始位點區域DNA甲基化在DPPA3敲除后都升高（圖5b-d）。DPPA3敲除后，基因間區DNA甲基化同樣升高（圖5e），提示其作為遠端調節區域和3D染色質相互作用的潛在位點 。表明8CLC轉化過程中細胞功能和基因調控網絡的重組發生了重大變化。
圖5、DPPA3基因敲除后不同細胞甲基化變化
“這些全能性的8細胞期胚胎樣細胞重建了受精卵僅分裂3次后的胚胎狀態，相比過去的多能干細胞，這種細胞可以分化為胎盤組織，并可能發育為更成熟的各類身體組織，為全世界數百萬需要進行器官移植的患者帶來了福音。”論文的通訊作者，中國科學院Miguel A. Esteban教授、Md. Abdul Mazid博士和李文娟博士表示。
深圳市易基因科技有限公司聯合創始人，也是項目主要參與者王君文博士表示：表觀遺傳特別是DNA甲基化調控在胚胎發育過程中發揮重要的作用。哺乳動物受精后，精子首先經歷一個快速去甲基化過程。隨后，卵子來源基因組DNA在2細胞到8細胞發育期間進一步去甲基化，直到桑葚胚，整個受精卵基本完成甲基化去除。在隨后的約囊胚期，整個受精卵在DNA甲基化轉移酶DNMT3A和DNMT3B等一系列酶控作用下，精確完成DNA甲基化的重編程，調控細胞的定向發育。
參考文獻：
圖源Nature官網論文中，研究者設計了一種非轉基因、快速、可控的“細胞重編程”方法，將人的多能干細胞轉化為全能性的8細胞期胚胎樣細胞，重編程形成的8CLC在轉錄和表觀遺傳修飾上與人類8細胞胚胎十分類似。
首先，研究者通過人類胚胎干細胞(ESC)篩選了針對信號轉導和表觀遺傳途徑的抑制劑，以逐漸確定產生8CLC的允許培養條件。在第一輪中，研究者將MEK抑制劑PD0325901 (PD)，tankyrase抑制劑IWR1和人LIF跟化學培養基結合，獲得具有原始多能干細胞樣克隆形態和基因表達的人多能干細胞(圖1)。在第二輪中，研究者結合這種基礎培養基，測試了14種額外的添加成分，其中組蛋白H3K27甲基化轉移酶EZH2抑制劑DZNep和I類組蛋白去乙酰化酶HDAC抑制劑TSA的添加，顯著提升多潛能相關基因的表達。轉化過程經過約12天(3代)，無明顯細胞死亡(圖1)。 研究者將這種原始培養基命名為4CL(4種化學物質+ LIF)，并在多個雄性和雌性ESC和iPSC細胞系中驗證了它的有效性，觀察到達15代沒有明顯核型異常的干細胞維持。
研究者進一步觀察4CL中TSA和DZNep劑量的增加對原始多能干細胞的影響。結果發現， 5天后，這種增強的4CL培養基(e4CL)促進了TPRX1、ZSCAN4、ZSCAN5B、DUXA/B和ZNF280A等全能性基因的表達，這些基因在不同的原始培養基中，在PSC細胞中表達量較低，尤其是在擴展多能干細胞中(expanded pluripotent stem cells, EPSC)。
在e4CL培養基中，細胞的核型保持正常，但不能傳代進行擴增培養，這可能與全能性細胞缺乏自我更新能力有關。 始發態細胞在e4CL中直接培養7天也可以激活全能性基因(圖1)，這種方法稱為直接e4CL（direct e4CL），以區別于階梯式的，首先是4CL，然后是e4CL轉化(階梯式e4CL)。
圖1始發態PSC在4CL、階梯e4CL和直接e4CL培養基形成naïve PSC和8CLC的示意圖DNA甲基化是基因表達的重要調控因子，在早期胚胎發育、始發態向原始態多能干細胞轉化過程中，DNA甲基化將發生顯著動態改變。已有研究報道，人工誘導過程DNA大范圍的去甲基化與基因組穩定性的風險增加密切相關。研究者通過與胚胎發育8細胞DNA甲基化對比，探究e4CL培養基用于8CLC細胞轉化過程中，原始多能和全能性基因的甲基化變化情況。
首先，對始發態PSC、4CL 12天培養的原始態PSC和進一步e4CL 5天培養，以及直接e4CL 7天培養的細胞進行簡化基因組甲基化測序。結果顯示4CL 12天培養的原始態PSC甲基化水平比始發態PSC甲基化水平更低（圖2a），且與各種已發表的誘導技術相比，4CL 12天培養的原始態PSC基因組印跡位點與胚胎內細胞團 (ICM) 相似性程度更高（圖2b） 。直接e4CL 7天培養細胞甲基化水平與胚胎8細胞甲基化水平相似（圖2a）。
此外，通過對8CLC細胞，4CL 12天培養原始PSC細胞以及始發態PSC細胞進行全基因組單/微量細胞甲基化測序，結果顯示，8CLC甲基化水平比4CL 12天培養的原始PSC或始發態PSC細胞甲基化水平更低，跟8細胞胚胎甲基化水平相當（圖3a）。轉錄起始位點、gene bodies和特定基因元件（如增強子、CG島、LTR、SINE、LINE、intergenic和intragenic等），8CLC甲基化水平也同樣比4CL 12天培養的原始PSC或始發態PSC細胞甲基化水平低（圖3b，c）。
圖3、始發態PSC、4CL和8CLC微量/單細胞全基因組甲基化測序甲基化水平分析
無論是簡化基因組甲基化測序結果還是微量細胞全基因組甲基化測序，原始多潛能基因和全能基因甲基化水平都保持相對一致水平(圖4)。
圖4、全基因組甲基化測序分析原始多潛能基因（藍色）和全能基因（紅色）甲基化狀態改變為進一步探索8CLC細胞形成分子機制，研究者分析了不同細胞狀態的基因表達差異，發現449個基因表達在8CLC中上調，幾乎無下調基因。其中DPPA3和TPRX1基因處于上調前五基因內。已知DPPA3與UHRF1及DNMT1作用，控制小鼠卵母細胞被動去甲基化過程。DPPA3也通過調控印記基因甲基化修飾，參與到小鼠體細胞重編程過程。作者敲除DPPA3基因阻斷了始發態PSC細胞向原始態PSC細胞的轉化。敲除TPRX1基因阻斷了階段式e4CL和直接e4CL誘導8細胞胚胎標志物的形成，但是對4CL 12天培養原始態PSC的形成影響不大。與上述結果相對應，DPPA3基因敲除后，4CL 12天和e4CL 直接7天細胞基因組DNA甲基化整體升高（圖5a）。DPPA5和KHDC3L等原始多潛能基因，以及TPRX1和TRIM43等全能基因轉錄起始位點區域DNA甲基化在DPPA3敲除后都升高（圖5b-d）。DPPA3敲除后，基因間區DNA甲基化同樣升高（圖5e），提示其作為遠端調節區域和3D染色質相互作用的潛在位點 。表明8CLC轉化過程中細胞功能和基因調控網絡的重組發生了重大變化。
圖5、DPPA3基因敲除后不同細胞甲基化變化“這些全能性的8細胞期胚胎樣細胞重建了受精卵僅分裂3次后的胚胎狀態，相比過去的多能干細胞，這種細胞可以分化為胎盤組織，并可能發育為更成熟的各類身體組織，為全世界數百萬需要進行器官移植的患者帶來了福音。”論文的通訊作者，中國科學院Miguel A. Esteban教授、Md. Abdul Mazid博士和李文娟博士表示。
深圳市易基因科技有限公司聯合創始人，也是項目主要參與者王君文博士表示：表觀遺傳特別是DNA甲基化調控在胚胎發育過程中發揮重要的作用。哺乳動物受精后，精子首先經歷一個快速去甲基化過程。隨后，卵子來源基因組DNA在2細胞到8細胞發育期間進一步去甲基化，直到桑葚胚，整個受精卵基本完成甲基化去除。在隨后的約囊胚期，整個受精卵在DNA甲基化轉移酶DNMT3A和DNMT3B等一系列酶控作用下，精確完成DNA甲基化的重編程，調控細胞的定向發育。
參考文獻：
- Mazid, M.A., Ward, C., Luo, Z. et al. Rolling back of human pluripotent stem cells to an 8-cell embryo-like stage. Nature (2022).
- Pastor, W. A. et al. Naive human pluripotent cells feature a methylation landscape devoid of blastocyst or germline memory. Cell Stem Cell 18, 323–329 (2016).
- Smith, Z. D. et al. DNA methylation dynamics of the human preimplantation embryo. Nature 511, 611–615 (2014).
- Wang, Y. et al. Single-cell multiomics sequencing reveals the functional regulatory landscape of early embryos. Nat Commun 12, 1247 (2021).
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