FFPE（formalin fixation and paraffin embedding）樣本，即福爾馬林固定石蠟包埋的組織樣本。它承載了眾多疾病的關鍵信息，又可長期室溫保存，所以是病理科當之無愧的“瑰寶”。在世界范圍內，大約有數十億份組織樣品存儲在醫院或生物樣本庫中，其中絕大多數是FFPE樣本。

但是，FFPE樣本也因為福爾馬林的固定容易使組織中的核酸發生不同程度的降解和分子間的交聯，石蠟的高溫滲入過程進一步加速核酸的降解，保存的時間及環境對樣品中的核酸也有巨大的影響。

因此，從FFPE樣本中提取出高質量核酸，并構建出信息完整、無偏好、可用于后續各類組學研究的文庫，則是“大大”的難題。

目前，針對FFPE樣本，10x Genomics已有單細胞轉錄組和空間轉錄組解決方案，了解這些前沿技術，助力您全方位解鎖FFPE樣本中蘊含的寶貴信息。

 圖1  FFPE樣本可用的前沿技術

一  FFPE樣本單細胞轉錄組測序

1.1 實驗原理

針對 FFPE切片，使用二甲苯脫蠟；使用膠原酶、胰蛋白酶等多種酶來消化組織，制備單細胞懸浮液，進而抽核得到細胞核樣本；建庫時采用靶向基因的探針對雜交目標RNA分子后連接的原理，進而完成文庫構建的過程；該方法可以用來分析數千個至數萬個細胞核的基因表達，可檢測出人類或小鼠全轉錄組，尤其是低表達量的基因。

1.2 實驗所需10x設備-Chromium X

Chromium X相當靈活，適合任何實驗室，能夠在單次運行中分析數百至數十萬個細胞，讓百萬級的細胞研究變得常規。

FFPE單細胞轉錄組油包水制備過程是在Chromium X設備當中進行的，運行時間僅需5.5min，運行溫度要求18-28℃，運行濕度要求30-80%相對濕度。

圖2   油包水生成示意圖

圖3   油包水制備過程儀器界面圖

1.3 技術流程圖

圖4 FFPE 樣本單細胞轉錄組實驗流程圖

1.4 樣本要求：

由于受蠟塊年齡、組織類型、固定前組織質量、組織密度、組織面積以及其它因素的影響，致使相同面積和厚度的組織解離后獲取的細胞數量也存在較大差異。

對于人和小鼠的組織切片要求詳細如下：

人組織：建議每張切片厚度 25um，每 2 張切片放入 1 個 1.5mL 無核酸酶離心管中，建議多準備 1-2 管備用。

小鼠組織：建議每張切片厚度 50um，每 2 張切片放入 1 個 1.5mL 無核酸酶離心管中，建議多準備1-2 管備用。

FFPE組織質量要求DV200>30%。

以下列出了 10x Genomics 公司已測試的 FFPE 組織切片，以及解離后單細胞懸浮液的細胞產量。參考該測試數據，可以估計特定組織類型/切片的近似細胞產量。


 

二 Visium CytAssist空間轉錄組測序

2.1 帶您認識Visium CytAssist

全新的Visium CytAssist是一款小巧的臺式儀器。能夠將轉錄組分析物從標準的載玻片轉移到Visium玻片上，便于您從更多種類的樣本中獲得空間分析的見解。CytAssist儀器與蘇木精-伊紅（H&E）染色或免疫熒光（IF）染色的FFPE組織切片兼容，讓預先以切片形式保存的組織也能用于Visium工作流程。您可以通過標準的組織學技術篩選組織切片，找到有生物學意義的切片，然后用CytAssist儀器將這些切片與Visium玻片的捕獲區域精確對齊，從而最大限度發揮Visium實驗的作用。

圖5 Visium CytAssist - 空間組學組織分析物轉移系統

2.2 技術流程圖

圖6   基于Visium CytAssist的FFPE空間轉錄組測序流程圖

2.3 樣本要求：

2.3.1 樣本類型

①常規HE染色的FFPE切片

②FFPE組織蠟塊

2.3.2 RNA質量

提取FFPE切片中總RNA，質檢DV200，要求DV200>30%。

2.3.3 組織大小

根據要研究的組織區域大小，提供6.5mm x 6.5mm或11mm x 11mm兩種空間轉錄組玻片供選擇。

2.4 載玻片要求：

標準載玻片規格為25 x 75mm，由于不同廠家規格存在差異，可用于 Visium CytAssist平臺的載玻片最小規格為24.8 x 74.4mm，最大規格為25.3 x 76.2mm。

圖7  可用于Visium CytAssist 的4種載玻片

2.5 貼片要求：

組織需張貼在不同規格載玻片中的綠色框內（上圖），超出綠色框的組織將無法在后續Visium CytAssist平臺轉片時被捕獲到。