生物體是由復雜多樣的細胞構成的，其結構與功能通常是作為一個整體表現出來的。在器官乃至全身水平上，高分辨地獲取生物組織三維結構信息對諸多生物醫學相關的研究至關重要，例如神經科學中大腦神經元連接信息的繪制、發育生物學中器官的形態發生等。

近年來興起的組織光透明技術是利用化學或物理的原理與方法將大塊組織或完整器官甚至活體動物透明化處理的技術，通過采用多種物理、化學的手段，減小組織對光的衰減，使得生物組織變得對光“透明”，從而提高了光學成像的成像深度與成像質量。該方法與多種熒光標記技術、光學成像技術的結合為高分辨獲取組織器官的三維整體結構信息提供了重要的手段，彌補了傳統機械切片顯微成像技術的不足，在生命科學特別是神神經科學領域產生了巨大的影響，作為新興起來的一種生物組織學技術，受到了越來越多科研人員的關注與青睞。                                                                                                      

最早見諸報道的組織光透明技術是德國科學家Werner Spalteholz用苯甲醇和水楊酸甲酯混合物“清除”心臟等大型器官。而最早嘗試腦組織光透明的方法，可以追溯到2007年維也納科技大學和德國馬普研究所的研究者首次使用苯甲醇和苯甲酸芐酯的混合物（BABB）透明小鼠全腦，并繪制出3D小鼠腦神經網絡。在此之后組織光透明技術迅猛發展，到如今已經有幾十種組織光透明相關技術。

圖2：不同離體組織透明方法發展歷史

正常的生物組織中成分復雜，如蛋白質、脂質和血紅素等物質對光的傳播造成阻礙。光透明技術使用一種試劑或幾種試劑組成的混合液通過浸泡、電泳或灌注等處理方式,使大塊組織或完整器官達到視覺下透明或光學儀器下可見的效果，簡單來說就是讓這些生物組織具有光學透明特性，利用這種技術實現透明的腦標本稱為透明腦。Dodt等人在2007年首先完成了對出生后10天幼鼠全腦的透明，并命名為Murray透明法或BABB。Murray透明法的出現使得完整觀察神經網絡成為可能，并帶動了現代組織透明技術的發展。這種技術的優勢在于不破壞組織完整性的同時具有三維成像的能力。在此基礎上，組織透明技術經諸多科研機構努力涌現出了多種具體方法,并不斷完善和持續更新;最早實現透明的器官是腦，逐漸拓展至脊髓及其他器官;組織透明適用的物種也由起初的小鼠，逐漸擴展到大鼠、兔、非人靈長類動物乃至人類。

圖3：大小鼠不同離體組織器官透明前后圖

完整的器官之所以不透明與其組成物質有關，組織中含有水、蛋白質、脂類等多種不同物質，各物質折光系數不盡相同,當光線通過這些不同組分時發生散射，并且組織或完整器官越厚散射越強透射越少，從而導致光學觀察受到了限制。基于這一理論，現有的光透明技術的原理大致可分為兩類：一類是去除折光系數差異較大的物質,選擇性的去除組織器官中的某些物質可以減少折光系數間的差異。鑒于蛋白質是絕大多數生物醫學研究的目標分子，所以需要使用脫水或脫脂的方法來實現組織透明，而且脫水或脫脂越徹底，組織透明效果越好。第二類主要是使用與組織折光系數相似的介質溶液利用浸泡或灌注的方式使組織器官透明。事實上隨著光透明技術的不斷發展，幾乎沒有一種透明方法單純的使用一種透明原理，而是綜合多種原理來實現組織透明。

圖4：組織光透明原理

由于研究的需要，許多時候需要在研究生物體存活時觀察并監測體內活動，如在活體動物觀察腦血管或腦神經。目前腦血管或腦神經的在體觀察主要通過光學顯微鏡，此類光學儀器在要求分辨率的情況下無法實現較深層成像，其成像對比度和深度都受到限制。因此將光透明技術引入到活體組織觀察腦血管或腦神經，在解決成像對比度和深度這兩大關鍵問題方面具極大潛力。佳維斯（武漢）生物醫藥有限公司核心技術團隊將活體光透明技術引入到激光血流成像和雙光子顯微成像的相關研究課題中，根據長期對該技術的研究和發展形成了活體顱骨光透明技術、活體皮膚光透明技術和活體硬組織光透明技術等活體光透明系列技術，可大大提高活體顱骨及皮膚成像深度與分辨率。

透明前顱骨和透明后顱骨對照

激光散斑血流成像技術能夠實時直觀地觀察皮下血管結構并評估其功能，不僅是了解正常的活體器官生理，而且對觀察各類疾病中微血管功能障礙進展與神經退行性變之間的關系也至關重要。其原理為觀察目標受到激光束照射時，反射后的激光形成隨機干擾圖像（包括亮區和暗區），該圖像稱為激光散斑圖。如果被測目標靜止，激光散斑圖也保持不變；如果被測物體發生移動，例如組織中的紅細胞運動，則激光散斑圖會隨之波動。散斑變化速度以散斑對比度量化，而對比度與血流相關；這就是激光散斑血流成像技術用于血流流速變化和灌注量評估的工作原理。

就像所有的光學成像技術一樣，激光散斑血流成像技術也受限于成像深度，對皮膚表面的血管和血流能夠成像，再深層就很難進行觀察。引入活體光透明系列技術，不但可以提升激光散斑血流成像深度，而且提升了分辨率，以下的實驗結果表明活體光透明后激光散斑血流成像的結果更清晰，背景更為“清澈”。

(a)為小鼠耳朵圖像， (b)為透明化5min后耳朵圖像，(c)為10min后耳朵圖像                       

在很多動物實驗中都需要開顱手術以進行相關的實驗，活體顱骨光透明后無需開顱即可進行這些實驗。目前完整顱骨是觀察小鼠大腦皮下神經和血管的主要障礙，為了克服這一障礙，科研工作者們開發出幾種類型的顱窗，包括磨薄顱窗、開顱手術和磨薄加固顱窗等。這些顱窗在某些情況下滿足研究要求，但有局限性。例如，在顱骨窗變薄的情況下，很難進行大面積重復成像；開顱手術幾乎不可避免地會導致皮質損傷和炎癥；至于磨薄加固顱窗操作復雜且也會造成損傷。而活體組織光透明的應用解決了這些問題。通過在顱骨上進行組織光透明，可直接觀測小鼠大腦皮下血管，不用對顱骨造成損傷。

圖8：顱骨透明前無法觀察到任何血管，顱骨透明15min后，肉眼可見大量皮質血管。在PBS清洗干燥后，頭骨再次回復最初狀態。再反復透明處理，還能觀察到血管。最后在同一區域建立光學顱窗，與透明后效果類似。觀察到的皮質血 管結構與通過光學透明顱窗觀察到的相同，兩種情況下都能清楚地區分大血管和微血管。

如同激光散斑成像碰到“小鼠顱骨”的問題一樣，在皮質上小鼠顱骨也阻礙了熒光標記的神經元結構和微血管的觀察。同樣，活體顱骨光透明技術也能輔助雙光子顯微鏡進行更深層成像，無需顱窗手術“越過”顱骨成像觀察大腦皮層結構。

根據以上結果可以明顯發現，活體光透明處理后雙光子成像的信號強度明顯增強，且成像深度也大大提高。這些結果表明，光透明處理顱骨不僅提高了雙光子顯微鏡的成像分辨率和對比度，而且還大幅提升了成像深度。

活體顱骨光透明技術操作簡單、安全有效，結合雙光子顯微鏡或激光血流成像儀，能夠反復觀察腦皮層的微血管、神經元和小膠質細胞等。與現有的顱窗手術技術相比，無需對顱骨進行磨薄或移除，從而不會造成損傷。這種方法也被證明是安全的，幾乎不會造成意外損傷或感染。由于不會造成炎癥，此技術也更適合對微環境高度敏感的免疫細胞（膠質細胞）進行研究。因此，活體顱骨光透明技術無需對顱骨進行磨薄或切除，可以在大腦正常狀態下觀察皮層神經和血管網絡結構與功能，且可以長期可逆透明成像觀測。

活體光透明技術作為一種新興的活體成像樣本制備技術，具有革命性的意義。在維持活體器官活性和完整性的同時具有光透明特征，不但廣泛應用于活體激光血流成像的相關研究，在輔助雙光子觀察神經元和血管的應用方面及近紅外成像等方面也具有廣闊前景，可大大提高這些活體光學檢測設備成像深度和分辨率。