新鮮冷凍（FF）和福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）樣本均適用于多重免疫組化（mIHC/mIF）。開展多重免疫組化（mIHC/mIF）的樣品制備方法時，應考慮保存組織結構、長期儲存條件、抗原可及性和易于進行組織成像。FFPE標本處理法比大多數FF方法更好地保留了整體組織結構和細胞形態。實踐中，為方便室溫保存，大多數臨床組織以FFPE塊的形式保存，但FFPE法使許多目標抗原無法充分暴露，常常需要抗原修復。此外，福爾馬林固定也增加自體熒光。特別要注意的是，與單一標記物IF/IHC相比，適用于一個抗原修復的條件可能不適用另一個抗原修復，使得多重免疫組化（mIHC/mIF）的開發頗具挑戰性。相反，FF組織不需要抗原修復，但需要立即快速冷凍和超低溫儲存（<-80°C），以實現最佳組織保存。好消息是，使用1%多聚甲醛和去污劑法已被證明能夠很好地保存組織結構，還能通過溶解紅細胞使組織熒光最小化，并且能夠在人類和小鼠組織中無需使用抗原修復，大多數抗體就可以直接進行免疫染色。

成本

在規劃開展多重免疫組化（mIHC/mIF）業務時，一個常常大家被忽視的因素是總體成本和花費的時間，主要花費到包括試劑、抗體、培訓、抗體組合優化、圖像采集和數據分析上（圖三）。評價花費是否合理的重要一點是每單位數據的成本（例如每個抗體染色的成本）和從多重染色中產生新發現的能力。往往一個單項IHC/IF實驗可能花費數百元，而一個50種抗體組合的多重檢測模塊可能需要數千元。導致多重檢測的時間和成本大幅增加的因素包括多重檢測的復雜性（抗體數量、樣本類型、樣品制備步驟等）、多個檢測循環時目標抗原的穩定性、在統一免疫標記條件下抗體兼容性和性能，以及檢測循環中抗體組合和先后順序的設計、調整，只有在上面提到的因素都進行最優化處理，才能獲得最佳結果。

下游的分析是至關重要的：例如圖像定標（例如DAPI或Hoechst 33342核染色圖像定標）,魯棒性的細胞分割（例如核和膜染色分割）和無監督聚類（例如基于多種生物標志物組合染色的細胞表型分型）。梳理要囊括進一個mIHC/mIF檢測模塊中的生物標志物時，建議將生物標志物按“必須有”或“最好有”進行排序和分類，從而大大加快整個多重mIHC/mIF的開發。這些信息，連同預算和大致開發進度表，將決定一個多重mIHC/mIF檢測模塊要包括的生物標志物的數量。生物標記物的選擇可以參考專家意見、現有文獻、正交數據集和/或在線資源。搞定生物標志物目標清單之后，下一步就是評估和購買合適的抗體。近年來，產生了多個抗體數據庫和搜索引擎（見系列4表），提供直觀的用戶界面。除了能發現高引用的抗體克隆外，這些平臺還允許研究人員查詢許多相關領域，如組織和細胞類型、應用、公司和宿主物種，同時通常提供參考染色圖像。從這些資源開始往往是一個很好的開端，幫我們找到在傳統單IHC染色中顯示魯棒性的試劑。然而，這些數據庫往往沒有與多重mIHC/mIF檢測相關的性能細節，例如抗原穩定性、抗原抗體結合位點的空間位阻以及與其他抗體的兼容性。出于這些原因，我們可以提供了一份先前成功使用FF、或FFPE制備的小鼠和人體組織進行多重免疫組化mIHC/mIF染色并得到驗證的抗體列表，作為創建自定義檢測模塊的起點（需要請聯系南京泰立瑞信息）。對希望常規開展mIHC /mIF的實驗室，我們建議以已知或已驗證的抗體或抗體模塊及其使用先后順序為基礎，創建基礎抗體模塊，再通過添加感興趣抗體到基礎抗體模塊中，形成新的模塊，解決和回答新問題，這種方法減少了創建一個mIHC/mIF時抗體驗證相關的時間和資金。此外，具有質量控制措施的重組單克隆或多克隆抗體提供了最少的批間變異，使其更適合于高度復合的抗體模塊開發。還應該優先使用有嚴格質控的雜交瘤衍生單克隆抗體，最后才考慮多克隆抗體。對每個供應商的每個批次都要進行基于特定應用和特定樣本的測試，以確保實驗重現性。