揭示小鼠胚胎母源-合子轉換過程中的RNA m6A動態

瀏覽次數：2854　發布日期：2023-4-27　來源：本站　僅供參考，謝絕轉載，否則責任自負

中科院腦智卓越中心揭示小鼠胚胎母源-合子轉換過程中的RNA m6A動態

母源-合子轉化(MZT)是卵母細胞由母源環境向合子基因組驅動的表達程序轉變的一個基本而保守的過程，這一過程將最終分化的卵母細胞和精子重新編程為全能性狀態。MZT是由母體mRNA和蛋白質啟動，隨后逐漸轉為合子基因組激活（ZGA），并伴隨著母源RNA和蛋白質的清除。胚胎發育的一個關鍵問題是MZT如何被調節。然而，盡管母體沉積的快速清除的mRNA和新合成的合子RNA產物在推動早期胚胎發生方面具有重要意義，但RNA控制的各種機制仍然知之甚少。N6-甲基腺苷(m⁶A)是高等真核生物信使RNA (mRNA)中最常見的內部修飾，在細胞命運維持和轉變過程中發揮重要作用。但是m⁶A修飾對MZT過程中RNA代謝的潛在調節作用尚不清楚。

2023年4月，中國科學院腦科學與智能技術卓越創新中心（神經科學研究所）劉真研究組、孫怡迪研究組與上海交通大學醫學院公共衛生學院單細胞組學與疾病研究中心李辰研究組合作在Genome Biology（IF 17.906）期刊發表了題為“Reading and writing of mRNA m⁶A modification orchestratematernal-to-zygotic transition in mice”的研究論文。該研究利用SLIM-seq技術繪制出小鼠胚胎母源-合子轉換過程中RNA m⁶A修飾動態圖譜，并通過蛋白質組學分析和CRISPR/Cas13d介導基因敲低揭示m⁶A的讀寫對于小鼠著床前胚胎發育的影響。中科新生命為研究提供4D-DIA蛋白質組學技術支持。

研究材料

小鼠的MII卵母細胞、晚期1細胞胚胎(L1C)、晚期2細胞胚胎(L2C)

技術路線

步驟1：MZT期間m⁶A標記mRNA的動態圖譜分析；

步驟2：m⁶A修飾功能分析：促進RNA衰變，亦可維持RNA穩定；

步驟3：m⁶A修飾通過維持mRNA的穩定性調控MZT；

步驟4：Ythdc1結合m⁶A修飾的mRNA并調控其穩定性。

研究內容

1. MZT期間m⁶A標記mRNA的動態圖譜分析

為了揭示MZT期間m⁶A的動態圖譜，作者對小鼠的MII卵母細胞、晚期1細胞(L1C)和晚期2細胞(L2C)胚胎進行SLIM-seq（微量樣本m⁶A測序技術）分析(圖1a)。SLIM-seq中共鑒定到3396個m⁶A標記的mRNAs和973個m⁶A標記的ncRNAs（圖1b）。與RNA-seq對比分析發現m⁶A標記的mRNA數量在受精后顯著減少，而在合子基因組激活(ZGA)期間增加，在不同階段，m⁶A水平的變化與m⁶A標記mRNA數量的變化相同，揭示了早期胚胎發育過程中m⁶A動態的三種主要模式：母體丟失、一致遺傳和新生獲得(圖1c-1e)。綜上所述，小鼠MZT期間m⁶A標記的mRNA呈現高度動態變化。

2. m⁶A修飾功能分析：促進RNA衰變，亦可維持RNA穩定

卵母細胞的成熟和受精均伴隨RNA的降解，之前的研究表明m⁶A結合蛋白Ythdf2在母體RNA衰變中發揮重要作用。m⁶A是否參與了受精后RNA的降解仍未知。SLIM-seq分析發現982個m⁶A標記的基因在MII卵母細胞中特異性富集而在受精后丟失,且近半的標記基因其mRNA表達水平下降，表明m⁶A對這些mRNA具有促衰變作用。1243個基因從L1C到L2C中被m⁶A新標記，即在是受精后重新產生，且近半新標記的基因的mRNA表達水平增加。另外發現609個m⁶A標記基因一致地從MII卵母細胞遺傳到L2C胚胎，其mRNA水平上亦沒有變化（圖1f-1g）。綜上所述，除了促進RNA衰變外，m⁶A修飾還參與維持RNA的穩定性。

圖1 小鼠MZT期間m⁶A動態圖譜分析和功能分析

3. m⁶A修飾通過維持mRNA的穩定性調控MZT

由于m⁶A修飾的基因是遺傳的，故作者推測這些mRNA是為了促進翻譯而維持的，并與哈佛大學張毅團隊發表的同時期LiRibo-seq翻譯圖譜進行比對分析。結果顯示，在609個m⁶A標記基因中，LiRibo-seq數據中可檢測到559個(圖2a)，且其中大多數基因在L1C和L2C階段翻譯水平升高，表明母系遺傳的m⁶A標記mRNA在此階段進行了翻譯（圖2b）。隨后作者采用4D-DIA蛋白質組學的方法進一步驗證，每個蛋白質組樣品僅使用20個小鼠卵母細胞或胚胎細胞，共檢測到5328個基因編碼的5353種蛋白質。其中LiRibo-seq數據中可檢測到的559個基因中有333個基因在蛋白質組學中亦檢測到了。聚類分析發現在MZT期間，大多數基因的表達水平保持或增加。GO分析結果顯示，這些基因顯著富集在mRNA和蛋白酶體調控中(圖2c-2h)。綜上，母系遺傳的m⁶A標記的mRNA通過維持穩定性用于翻譯，進而調控MZT。

4. Ythdc1結合m⁶A修飾的mRNA并調控其穩定性

mRNA的m⁶A修飾受多方面的調控：甲基轉移酶、脫甲基酶和 m⁶A結合蛋白，它們在早期胚胎發育的不同階段發揮不同的作用。為了探究這些蛋白質對mRNA功能的影響，作者采用CRISPR/Cas13d技術同時敲低小鼠受精卵中m6A的調控因子Ythdc1和Ythdf2，發現可以顯著影響小鼠著床前胚胎發育（圖2i）。為進一步研究Ythdc1對m⁶A標記的mRNA的影響，敲低Ythdc1的胚胎進行了轉錄組測序和RNA免疫沉淀(RIP)-qPCR等實驗，結果表明Ythdc1可以結合一些母源攜帶m⁶A的轉錄本，并參與其RNA穩定性調控(圖2j-2o）。