胰腺導管腺癌（PDAC）是最具侵襲性的惡性腫瘤之一，化學耐藥性是導致胰腺癌患者預后不良的主要因素。全身化療是控制疾病的主要治療手段，但是傳統的單藥或聯合化療方案均未顯示出令人滿意的療效。PDAC腫瘤微環境主要由細胞外基質（ECM）、癌癥相關成纖維細胞（CAFs）、浸潤免疫細胞和脈管系統組成，通過多種尚未完全闡明的機制在驅動腫瘤化學耐藥性方面起著至關重要的作用。CAFs 對作為胰腺導管腺癌一線用藥的吉西他濱具有天然抗性，其中涉及多種機制，例如誘導腫瘤細胞中的抗凋亡/促存活通路、改變腫瘤吉西他濱的代謝和釋放外泌體等。

忽視腫瘤-基質相互作用的次優腫瘤建模（Suboptimal tumor modeling）被認為是臨床前高藥物損耗率的重要因素。因此，迫切需要將基質成分納入藥物篩選模型。PDAC腫瘤類器官近年來作為3D體外疾病模型出現，能夠保留原始腫瘤的內在異質性和遺傳改變。然而，基于純上皮類器官培養模型的藥物篩選未能考慮患者特異性腫瘤微環境的參與。因此，將相關基質成分摻入類器官培養物是優化腫瘤組織建模和藥物反應預測的關鍵一步。

異細胞類器官培養有助于掌握CAF異質性并剖析復雜的腫瘤-基質相互作用。例如，使用小鼠類器官共培養系統鑒定出兩種不同但具有可塑性的CAF亞型，即myCAFs 和 iCAFs。Tsai團隊建立了包括CAFs和T細胞在內的PDAC類器官的培養，進一步證明了這些模型適用于研究PDAC腫瘤微環境。然而，使用匹配的3D異型類器官培養物進行個性化藥物篩選分析尚未報道。

2022年10月，來自德國海德堡大學醫院歐洲胰腺中心、柏林夏里特醫學院及奧地利維也納醫科大學普外科等團隊在 Journal of Experimental & Clinical Cancer Research 雜志發表了題為“Patient-specific modeling of stroma-mediated chemoresistance of pancreatic cancer using a three-dimensional organoid-fibroblast co-culture system” 的文章。該研究建立了患者來源的PDAC類器官（PDOs）和患者匹配的CAFs的直接3D共培養模型，使用基于實時圖像的藥物測定DeathPro，探討了CAFs對一線化療藥物吉西他濱，5-氟尿嘧啶（5-FU）和紫杉醇的PDO化療敏感性的影響，并在單細胞水平上闡明了腫瘤-基質相互作用誘導的轉錄變化。
 

首先，建立了5對患者匹配的PDAC腫瘤類器官（PDAC-PDOs）和CAFs直接的3D共培養模型。證據表明，CAFs在3D培養模型中促進腫瘤細胞的增殖，在5個匹配的共培養物中有4個觀察到CAFs對PDAC類器官增殖的增強作用。

接下來，在PDO單培養和PDO/CAF共培養中，評估PDOs對臨床治療中常用的三種化療藥物，即吉西他濱、5-FU和紫杉醇的敏感性。

通過DeathPro、Hoechst和propidium iodide染色等方法，實驗觀察到響應曲線的細胞死亡和增殖抑制參數的強相關性。在沒有藥物治療的對照條件下，CAFs對類器官增殖的增強作用導致共培養中類器官的相對生長比單培養平均增加1.3倍。對照條件下，類器官中細胞死亡的基礎水平在單培養和共培養之間沒有顯著差異。

吉西他濱、5-FU和紫杉醇處理誘導的細胞死亡在PDO單培養中顯著高于PDO/CAF共培養（圖1 A、B）。在共培養條件下，平均死亡值顯著降低，表明CAFs的存在導致類器官對化療的細胞毒性作用的抗性增加。然而，這種影響的程度是患者和藥物特異性的，提示腫瘤-基質相互作用對化療耐藥機制的影響存在異質性。共培養中的PDOs也顯示出吉西他濱誘導的增殖抑制降低（圖1 C、D）。5-FU僅觀察到最大值顯著的下降。紫杉醇處理后，在CAFs存在下，類器官增殖抑制沒有顯著差異（圖 1 C、D）。值得注意的是，紫杉醇在抑制類器官增殖方面不如吉西他濱或5-FU（圖1 C）。

這些數據表明，CAFs對吉西他濱，5-FU和紫杉醇對PDAC-PDOs的細胞毒性作用具有保護效應，直接促進了腫瘤細胞耐藥性，進一步強調了異型培養模型與個性化體外藥物檢測的相關性。

圖1   類器官與匹配的CAFs共培養時藥物敏感性降低。

（A、B）與CAFs共培養時，吉西他濱、5-FU和紫杉醇誘導的PDAC類器官的細胞死亡顯著降低。（C、D ）吉西他濱誘導的PDAC類器官中的增殖抑制在共培養中顯著降低（AUCpi, max. PI）。對于5-FU，max 明顯較低。在共培養中觀察PDAC類器官的PI（增殖抑制）。

然后，為了深入了解CAFs觸發的PDAC類器官化療耐藥性增加的機制，實驗進行了scRNA-seq以鑒定PDO/CAF共培養中誘導的轉錄變化，在3D單培養和共培養5天后對3株類器官和患者匹配的CAFs進行單細胞測序（圖2 A）。類器官細胞通過腫瘤標志物KRT18和KRT19的表達進行鑒定，而CAFs通過DCN和LUM表達來鑒定（圖2 B）。實驗觀察到，類器官和CAF群體的患者特異性聚類，表明單體樣本之間的轉錄異質性（圖2 B）。

所有測序的CAFs聚類可以區分出7個轉錄簇（圖2 C、D），它們具有不同的功能特征。在共培養中，觀察到第5簇的CAFs的比例增加（圖2 E），其特征在于與細胞周期相關的基因表達較高，表明共培養中CAFs的增殖可能增加。另一方面，與炎癥、運動和TNF-α信號傳導相關的第1簇的比例在共培養中降低（圖2 E），盡管這僅限于單個樣本（112）水平的情況。然而，由于CAFs亞型之間的解離效率可能存在差異，這些數據的比例可能無法完全反映培養物中的細胞數量。

而且與單獨培養CAFs相比，共培養的CAFs集群也呈現差異化表達。在iCAF和myCAF兩種不同的轉錄簇分析中，88.5% 的CAF群體對應于myCAFs（6509個細胞），而11.5% 被歸類為iCAFs（847個細胞）。iCAFs幾乎完全對應于炎癥相關的簇1（圖2 F）。iCAF標記基因在共培養環境中的表達水平高于單培養（圖2 G）。

通過對所有細胞簇中差異表達基因的基因集富集分析，進一步比較了單培養和共培養中的CAFs。共培養中兩個顯著富集的基因集與增殖有關（圖2 H）。在共培養中富集最高的基因集中，發現了與炎癥相關的標志性基因集（圖2 H、I）。

這些數據表明，與PDAC類器官共培養誘導CAFs中的促炎表型，這可能驅動腫瘤細胞中增強的化療耐藥性，并且可能提供治療分子靶點。

圖2   與PDAC類器官共培養后，CAFs中的炎癥途徑表達上調。

（A）用于單細胞RNA測序的樣本概述。（B）所有單細胞轉錄組的 UMAP 表示。虛線表示CAF和PDAC細胞。（C）來自單獨培養和共培養樣本的CAFs的綜合UMAP表示，其中7個聚類。（D）C中每個 CAF 簇的前五個富集基因的單細胞表達。（E）CAFs在單培養和共培養中7個簇中的分布。（F）iCAF樣和myCAF樣細胞的分布。（G）在F中鑒定的 iCAF 樣和 myCAF 樣群體中 iCAF 和 myCAF 標記基因的表達，比較單培養（藍色）和共培養（紅色）。與單培養相比，共培養中CAF中選定的Hallmark（H）和Reactome（R）通路上調。（I）在單培養（藍色）和共培養（紅色）中， CAF 中 TGFβ、IFN 和 TNFα 信號通路相關基因的表達，顯示共培養條件下表達增加。

所有測序的PDAC-PDO細胞中鑒定了8個轉錄簇。每個簇的比例在類器官系之間不同，反映了患者特異性轉錄異質性。有趣的是，與單一培養相比，沒有觀察到共培養中PDAC類器官細胞的任何已鑒定轉錄簇的增殖評分有顯著變化。

最后，通過在單細胞水平上對每個亞型基因特征的表達進行評分，進一步根據PDAC中的兩種主要轉錄亞型（即經典亞型和基底樣亞型）來表征PDO細胞。在單培養和共培養條件下未觀察到亞型評分的顯著差異，表明CAFs的存在不會在模型中誘導腫瘤細胞亞型狀態的轉變。

為了評估與CAFs共培養誘導的轉錄變化，分析了PDAC類器官細胞在單培養和共培養條件下的差異表達基因。與上皮-間充質轉化相關的幾個基因，如COL1A1，COL1A2，FN1，LAMC2和VIM在共培養的類器官細胞中上調。此外，還發現與炎癥相關的基因集在與CAFs共培養的類器官細胞中富集。

進一步關注已鑒定的PDAC細胞轉錄簇的EMT標記，發現在共培養條件下幾乎所有簇的EMT表達評分都有所增加。幾個單獨的EMT相關基因的表達在共培養中也上調。通過結合Cell Phone DB（配體-受體相互作用的開放庫），檢測到PDO細胞（受體）和CAFs（配體）之間潛在的細胞間受體-配體相互作用。此外，在PDAC類器官細胞和CAFs之間鑒定出與EMT相關的幾種受體-配體相互作用，如CD44-HGF，CD44-LGALS9或CD44-FGF2。通過免疫熒光染色，可以在原始組織中確認受體-配體相互作用對CD44-HGF的空間接近和共定位，支持了共培養模型中發生的腫瘤-基質相互作用的體內相關性。

這些數據表明，CAFs和上皮癌細胞之間的細胞間相互作用在共培養系統中得以復制，導致PDAC類器官細胞中EMT的上調和化學抗性增加。

總之，該研究表明，PDAC類器官在與患者匹配的CAFs共培養中的化療耐藥性增加，強調了復雜共培養模型與個性化醫療應用的相關性。這也為以患者特異性方式研究靶向腫瘤微環境的藥物的功效和作用方式提供了可能性。因此，這項研究為在高通量可接受的3D培養環境中模擬患者特異性腫瘤-基質相互作用以進行相關發現和藥物測試提供了可行性的證據。

參考文獻：Schuth S, Le Blanc S, Krieger TG, Jabs J, Schenk M, Giese NA, Büchler MW, Eils R, Conrad C, Strobel O. Patient-specific modeling of stroma-mediated chemoresistance of pancreatic cancer using a three-dimensional organoid-fibroblast co-culture system. J Exp Clin Cancer Res. 2022 Oct 22;41(1):312. doi: 10.1186/s13046-022-02519-7. PMID: 36273171; PMCID: PMC9588250.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36273171/

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