今天小編帶來一篇發表在Nature上的膠質瘤相關的文章解讀。該文章利用單細胞轉錄組技術找到了一群獨特的腫瘤細胞亞群，并利用GeoMx DSP空間轉錄組檢測技術確認了這群特殊腫瘤細胞在大腦組織中的空間位置分布。在這篇文章中，我們可以看到研究者是如何發揮單細胞和空間轉錄組技術的優勢，并將兩種不同技術的結果巧妙地串聯在一起，從而解析神經元活動促進膠質瘤進展的分子機制。

文章詳情

文章題目：Remote neuronal activity drives glioma progression through SEMA4F

中文題目：遠端神經元活動通過SEMA4F驅動神經膠質瘤進展

發表時間：2023.07

期刊名稱：Nature

影響因子：69.504

實驗平臺：10x Genomics 單細胞轉錄組測序+GeoMx DSP空間轉錄組等技術

DOI：10.1038/s41586-023-06267-2

01 研究背景

膠質母細胞瘤（GBM）是最具有侵襲性和致命的腦腫瘤，增殖率和對周圍腦組織的浸潤率高，易復發。GBM浸潤通常沿著血管和白質束，這些組織中包含神經元軸突，暗示了神經元可能參與腫瘤的浸潤。前人的研究已發現神經元活動可以促進腫瘤浸潤和發展，但是神經元活動是否通過旁分泌信號促進GBM以及驅動GBM浸潤的潛在分子機制尚不清楚，并且大腦中含有大量神經元亞型，哪些亞型可驅動GBM進展也有待探究。

02 技術路線

為了解決上述問題，本研究主要使用的研究方法和分析思路如下：

1.構建GBM小鼠模型，刺激原發癌對側神經元激活，并利用熒光監測腫瘤的浸潤情況，從而確認對側神經元活動是否能夠影響腫瘤的浸潤和進展。同時，結合數學模型和體外實驗，確認對側神經元的旁分泌因子與腫瘤浸潤的關系。

2.通過切斷胼胝體，或者選擇性激活對側腦神經元，以確認可能影響GBM浸潤和進展的神經元亞型。

3.利用單細胞轉錄組測序技術，確認GBM組織中腫瘤細胞在對側神經元活動的刺激下發生了怎樣的變化，并使用DSP空間轉錄組技術，確認這種變化的空間位置。

4.利用barcode screen技術篩選與GBM進展和浸潤相關的候選基因，并通過生存分析、過表達和敲除實驗確認候選基因功能，從而鑒定到目的基因。

5.對目的基因過表達的腫瘤組織進行單細胞轉錄組測序，以確認該基因是否能產生與對側神經元活動刺激后相同的腫瘤細胞變化。隨后，利用富集分析確認目的基因過表達后腫瘤細胞富集的信號通路。由于富集到的信號通路和目的基因家族都與突觸形成相關，因此研究者使用腦電圖檢測確認突觸重塑的方向。

03 研究結果

1. 遠端神經元活動可驅動GBM進展

刺激GBM小鼠原發區域對側的神經元活動后發現，刺激組的總生存期（OS）中位值與對照組相比顯著減少、Ki67上調表達，并出現了高級別腫瘤的典型病理特征。這些結果表明對側神經元活動的刺激可促進低級別腫瘤向高級別腫瘤方向發展。隨后，使用基于CRISPR-Cas9的子宮內電穿孔（IUE）模型進行研究。該模型中，GBM始發于單側大腦皮層，然后滲透穿過胼胝體到達對側半球。研究結果表明，對側神經元活動刺激可加速腫瘤的浸潤，上調Ki67的表達，而刺激同側神經元雖然可以增加腫瘤增殖，但腫瘤浸潤無顯著變化。最后，通過數學建模分析，發現與對照組相比，刺激組的腫瘤浸潤寬度相比于腫瘤質量增加。體外實驗則證實，用含有患者自發激活神經元的皮層樣品制備的培養基處理GBM球后促進了GBM的浸潤。綜上所述，這些結果表明神經元活動可通過分泌因子促進腫瘤的浸潤，而原發癌對側的神經元在進展的早期階段可促進這一現象。

Fig.1 遠程神經元刺激加速膠質瘤進展

2. CPNs促進GBM的進展

因為胼胝體投射神經元（CPNs）的軸突可沿著胼胝體橫跨皮層半球，因此研究者猜測是CPNs促進腫瘤浸潤。為了驗證這一猜想，研究者首先切斷了胼胝體，并發現對側神經元活動刺激后的腫瘤浸潤加速現象消失。當選擇性激活對側L2/3層神經元后（約80%的CPNs位于L2/3層），發現腫瘤浸潤水平增加，與全神經元激活時相當。這些結果表明，對側CPNs在推動腫瘤進展方面發揮關鍵作用。

Fig.2 胼胝體投射神經元促進膠質瘤的進展

3. 活動依賴性膠質瘤細胞亞群

單細胞轉錄組測序發現一群腫瘤細胞亞群，主要存在于對側神經元活動刺激的GBM中。對該亞群GO富集分析鑒定到 glutamatergic synapse和axon guidance。利用DSP空間轉錄組檢測技術鑒定到這個活動依賴性膠質瘤細胞亞群的marker基因主要表達在原發癌對側的浸潤性腫瘤細胞中。前沿細胞也富集到了與axon guidance相關的基因。在IVY-GAP數據庫中，這種浸潤性特征在人GBM的前沿區域也有類似而高度特異的富集。綜上所述，神經元刺激驅動了浸潤性細胞群的產生，而這些細胞群對應于膠質瘤腫瘤的前沿區域。

Fig.3 活動依賴型浸潤性膠質瘤細胞的鑒定

4. SEMA4F引導神經膠質瘤進展

使用barcode screen技術從43 個axon guidance基因中進行篩選，發現SEMA4F、EPHA6和EPHA7富集在對側區域和IVY-GAP數據庫中的腫瘤前沿區域。結合過表達/敲除實驗，發現SEMA4F的過表達減少了OS，并增強腫瘤的浸潤，敲低后則會產生相反的結果。為了確定SEMA4F是否通過細胞外機制對膠質瘤有貢獻，研究者過表達了SEMA4F的胞外域，發現可促進腫瘤的浸潤和增殖，并且在SEMA4F敲除腫瘤中過表達該基因胞外域可挽救由于敲除導致的腫瘤增殖和浸潤缺陷。這些結果表明，SEMA4F通過其外胞域介導了活動依賴性的膠質瘤進展，并通過與腦微環境的相互作用促進了腫瘤浸潤，暗示它通過與腦部微環境的相互作用調節了這一現象。

Fig.4 體內篩選鑒定SEMA4F是膠質瘤進展的驅動因子

5. SEMA4F促進大腦過度活躍

對SEMA4F過表達腫瘤進行單細胞轉錄組測序，發現活動依賴性的腫瘤細胞亞群也富集在過表達腫瘤中，并且包含axon guidance基因，進一步分析發現腫瘤細胞中的幾個突觸信號通路上調，包括glutamatergic synapse基因。對SEMA4F過表達的人膠質瘤細胞的Bulk RNA測序也富集到突觸信號和axon guidance通路。前人研究發現Sema家族成員和它們的PlexinB受體可以引發突觸形成，結合該基因胞外域在腫瘤進展中的作用，促使研究者評估SEMA4F過表達腫瘤周圍神經元中的興奮性/抑制性突觸，以及突觸重塑方向。結果表明，抑制性突觸減少，興奮性神經元增加，SEMA4F通過突觸重塑促進了腦網絡高活躍性。上述結果暗示SEMA4F自身驅動了這一活動依賴性浸潤性膠質瘤細胞亞群的產生。

Fig.5 SEMA4F促進突觸重塑和大腦過度活躍

04 主要結論

本研究發現位于原發性GBM對側半球的胼胝體CPNs促進腫瘤進展和廣泛浸潤，并鑒定到了存在于人和小鼠腫瘤前沿的活動依賴性浸潤腫瘤細胞亞群，富集了axon guidance基因。對這些基因的體內高通量篩選確定SEMA4F是腫瘤發生和活性依賴性進展的關鍵調節因子。此外，SEMA4F 通過將腫瘤相鄰突觸重塑為腦網絡過度活躍狀態，促進活動依賴性浸潤群體并傳播與神經元的雙向信號。這些結果表明，遠離GBM的神經元亞群促進了惡性進展，并揭示了由神經元活動調節的膠質瘤進展新機制。

參考文獻：

Huang-Hobbs, Emmet et al. “Remote neuronal activity drives glioma progression through SEMA4F.” Nature vol. 619,7971 (2023): 844-850.