如何提升CY5/CY5.5熒光成像效果之濾光片篇
 

一、cy5/5.5光譜特征圖

花氰染料cy5/cy5.5常用于生物分子標記，在熒光顯微成像、流式細胞儀分析、小動物活體標記成像中均有廣泛使用。Cy5最大激發波長一般在649nm，最大發射波長一般在670nm；cy5.5最大激發波長一般在673nm，最大發射波長一般在695nm。其激發特征在近紅外（紅外）譜段，且激發和發射波長半高寬（特征譜線中峰值一半對應的波長寬度）較窄，對濾光片組的選擇要求較高，否則熒光信號較弱或無法捕獲熒光信號。
 

左cy5光譜特征圖，右cy5.5光譜特征圖

二、Cy5/cy5.5熒光成像中的濾光片選擇

熒光成像基于斯托克斯位移原理，其基本表現為熒光物質經過特定波長的光激發，發射出較長波長的光。其激發和發射過程對應到熒光顯微成像系統中的兩個關鍵部件分別是熒光光源和熒光激發塊，Cy5/cy5.5的熒光成像原理也是如此，只是其激發和發射特征偏向于近紅外（紅外），對于濾光片的選擇需更加注意。

Stokes位移，能級躍遷產生熒光信號
 

發射光譜比激發光譜波長更長
 

cy5/cy5.5熒光成像的核心部件：熒光激發塊。由三片濾光片組成：激發濾光片、二向分光鏡、發射濾光片。激發濾光片允許特定波長的光通過；二向分光鏡反射短波長的光，透過長波長的光；發射濾光片，只透過所要觀察波長的光，把不需要的波長的光去除。
 

激發塊示意圖，由三組濾光片組成
 

熒光濾光片主要有三種，LP長通濾光片，限定波長長于指定值的光可以通過；SP短通濾光片，限定波長短于指定值的光可以通過；BP帶通濾光片，可以讓中心波長附近一定波長的光通過，當這個范圍比較窄的時候，我們還會給這種帶通濾光片“窄帶濾光片”的稱呼。
 

濾光片的三種類型：長通（LP）、短通（SP）、帶通（BP）
 

使用帶通濾光片可以獲得相對更高信噪比的熒光成像，而不同參數的帶通濾光片，會對成像效果有重大影響，比如下圖A和B兩組帶通濾光片，A組濾光片是窄帶，搭配比B組能多檢測出90%的有用信號，減少200%的背景干擾信號，在圖像上表現為A組信號更清晰透亮。此外，由于技術水平問題，國內窄帶濾光片的截止深度（OD）要比進口差，光譜表現為光通效率到邊緣“緩坡下降”而不是“斷崖下降”，最終成像效果不如進口窄帶，單要稍優于普通帶通。
 

窄帶濾光片成像更高信噪比
 

熒光信號的獲取在于激發光和發射光的選擇，激發濾光片需匹配光源中心波段與染料激發譜段，發射濾光片需覆蓋染料發射譜段峰值。以下是cy5、cy5.5兩個典型chroma公司濾光片組光譜圖。
 

Chroma CY5濾光片組EX:620/60，DM:660，EM:700/75
 

Chroma CY5.5濾光片組EX:650/45，DM:685，EM:720/60

三、明美濾光片選擇

濾光片的選擇應根據實際的應用、成本來綜合考量，進口大截止深度、小窄帶寬度的濾光片有更好的效果，但成本也是顯著更高的，某些僅能適用cy5/cy5.5幾種染料，某些適用范圍更廣，所對應的效果和成本也會有所變化，同時有的還考慮到與現有的光源、顯微鏡適配，選擇也會存在差異化。針對cy5/cy5.5等熒光染料，明美可提供國內和國外不同廠家不同品質型號的濾光片組，適用于奧林巴斯BX2或BX3系列、尼康Te/Ti系列、尼康50i/80i/90i、徠卡DM2500/3000/4000/5000/6000、蔡司Axio Imager等四大品牌多種信號，保證您的實驗效果，歡迎來電咨詢！
 

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