內皮細胞（ECs）在體內持續暴露于血流動力學剪切應力。當ECs感知剪切應力時，它們會改變細胞形態、功能和基因表達，并參與生理和病理血管生物學。對此，在血管中報道了兩種類型的剪切應力：一種是層流剪切應力，另一種是擾動剪應力。層流剪切應力（LSS）具有血管保護作用，位于直動脈區域（如胸主動脈），而擾動剪切應力（DSS）對血管有害，并且位于分支或彎曲區域（例如主動脈弓）。有趣的是，研究表明，血管分支所在的血管通透性增加，動脈粥樣硬化的風險也隨之增加。

剪切應力的機械轉導是復雜的。可以粗略地確定，剪切應力通過細胞膜分子激活各種傳導途徑，包括鈣通道、G蛋白、酪氨酸激酶受體、粘附蛋白和細胞骨架。在剪切應力作用下，ECs最直觀的表型是形態變化：ECs經歷了從多邊形鵝卵石狀向均勻紡錘狀單層的轉變。這種現象被認為部分是F-肌動蛋白應力纖維誘導的結果，然而，由于剪切應力導致的這種細胞骨架組的機制尚不清楚。

Latexin （LXN） 是一種長 222 個氨基酸的羧肽酶抑制劑。由于其蛋白酶抑制劑的特性，人們認為LXN可能參與蛋白質降解和代謝。LXN 也與炎癥有關，因為它在巨噬細胞和肥大細胞中表達，并且可以由脂多糖誘導。然而，LXN在ECs中的作用尚不清楚。

基于此，在廣西師范大學化學與藥學學院、廣西民族藥省部共建協同創新中心及桂林醫學院智能醫學與生物技術學院課題團隊的一項研究中，發現層流剪切應力誘導 ECs 中 LXN 的下調，從而導致細胞形態變化和 F-肌動蛋白重塑，類似于 LSS 在 ECs 中的作用那樣。從邏輯上講，研究人員假設 LXN 是一種新型調節因子，參與內皮細胞形態變化過程，并且 LXN 缺失對血管穩態具有保護作用。研究成果發表在 Journal of Cellular and Molecular Medicine 期刊題為“LXN deficiency regulates cytoskeleton remodelling by promoting proteolytic cleavage of Filamin A in vascular endothelial cells”。

首先，HUVECs承受15 dynes/cm² 的層流剪切應力持續12小時（圖1），結果觀察LSS誘導細胞形狀變化（圖1 A），上調血管保護基因（如CPY1B1、THBD和NOS3），但下調促動脈粥樣硬化基因（如VCAM1、CD36和ANGPT2）（圖1 B）。有趣的是，實驗發現LSS以時間依賴性方式顯著抑制HUVECs中LXN的表達（圖1 C-E），這促使研究人員思考LXN是否參與了ECs的功能調控。

為了探究LXN在內皮細胞中的功能作用，采用功能缺失策略。QPCR結果顯示，LXN敲低降低了HUVECs中ANGPT2，但增加了THBD和NOS3的表達，表明 LXN 敲低在 ECs 中具有血管保護功能。有趣的是，在LXN敲低ECs中觀察到細胞形態學變化和細胞骨架重塑，與LSS引起的ECs形態變化相似（圖1 A）。轉染CTL siRNA的ECs形態隨機排列，呈均勻多邊形，而用 LXN siRNA 轉染的 ECs 從典型的鵝卵石狀拉長到均勻紡錘狀排列，其方向與在LSS下生長的細胞在外觀上相似，并且LSS誘導的ECs形態變化可通過LXN的過表達逆轉。

通過F-肌動蛋白染色進一步研究了LXN缺失對內皮細胞細胞骨架重塑的影響。結果觀察到，LXN敲低導致肌動蛋白應力纖維的形成，主要在ECs中F-肌動蛋白絲的縱向分布中運行。有趣的是，實驗發現ECs在對照條件下表現出大而頻繁的板狀偽足形成，然而，LXN敲低細胞中的板狀偽足形成減少。這些數據清楚地表明，LXN至少參與了ECs中的內皮細胞形態變化和肌動蛋白細胞骨架重組。
 

圖1 層流剪切應力下調HUVECs中LXN的表達。

接下來，為了探究LXN調控內皮形態的機制，進行了蛋白質組學篩選，以鑒定ECs中LXN的細胞內靶點，為此，裂解HUVECs，并用抗LXN抗體進行免疫沉淀。FLNA是一種支架蛋白，被確定為LXN的潛在伴侶，通過免疫沉淀和蛋白質印跡進一步驗證了這種相互作用。實驗驗證了內源性LXN在HUVECs中與FLNA完全形成物理復合物。數據強烈表明，FLNA 可能參與與 LXN 的結合并在 ECs 中形成復合物。

細絲蛋白A（Filamin A，FLNA）是一種肌動蛋白交聯蛋白，可調節與細胞形態變化和運動有關的信號轉導事件。由于 LXN 調節細胞形狀，因此在研究中觀察到 ECs 中細胞骨架的變化和肌動蛋白重塑。LXN與FLNA的相互作用促使研究人員評估了LXN是否影響ECs中的FLNA蛋白水平。結果發現，LXN敲低不影響FLNA的mRNA水平（圖2 A），但顯著降低了ECs中FLNA的蛋白水平（圖2 B）。有趣的是，實驗發現了一個大約190 kD的新條帶，它也可以被FLNA抗體識別，表明FLNA可能被降解（圖2 B）。FLNA對鈣蛋白酶的蛋白水解非常敏感，因此，實驗推測LXN是否調節內皮細胞中的鈣蛋白酶活性。

實驗觀察到，LXN敲低ECs中的鈣蛋白酶活性增加（圖2 C）。因此，用鈣蛋白酶抑制劑Calpeptin處理LXN敲低ECs，通過蛋白質印跡測定FLNA及其片段，發現LXN敲低導致FLNA減少，同時FLNA裂解增加，然而，這種作用可以通過Calpeptin抑制（圖2 D）。隨后通過免疫染色和蛋白質印跡進一步確定了LXN敲低是否會影響ECs中全長和裂解的FLNA亞細胞定位。免疫染色顯示，FLNA與LXN在細胞質中共定位，LXN敲低顯著促進了ECs中FLNA從細胞質到細胞核的亞細胞易位（圖2 E、F）。有趣的是，Calpeptin可以逆轉LXN敲低誘導的應力纖維的形成（圖2 G）。這些數據表明，LXN維持了FLNA在細胞質中的穩定性，而LXN缺失通過鈣蛋白酶依賴性途徑下調FLNA，促進FLNA細胞核易位。
 

圖2 LXN 敲低調節 EC 中的 FLNA 蛋白水解裂解和亞細胞定位。

然后，實驗進一步探討了LXN敲低是否會影響細胞骨架蛋白的穩定性。結果顯示，敲低LXN后整合素-β表達略有升高，而paxillin、Arp2/3和α-actinin表達顯著降低（圖2 H）。由于據報道，樁蛋白（paxillin）與黏著斑（FA）和細胞骨架錨定的形成有關，因此接下來研究了 FLNA 是否對 ECs 中的細胞骨架錨定有影響，如圖所示4 I、F，在對照細胞中隨機排列的肌動蛋白絲與其末端與黏著斑相連。

然而，在LXN敲低細胞中，肌動蛋白絲與黏著斑之間的關聯被破壞，黏著斑等結構消失，從而導致F-肌動蛋白絲在細胞縱向上的分布，以及形態學變化（圖2 I-i）。接下來，又敲除ECs中的FLNA（圖2 J），發現斑塊等局灶性粘附受損，并導致肌動蛋白應力纖維的形成，主要在EC中F-肌動蛋白絲的縱向分布中運行（圖2 J-vi），這表明ECs中FLNA的減少有助于應力纖維的形成。這些數據顯示了，LXN作為FLNA蛋白質復合物的功能作用，參與調節ECs中黏著斑形成和肌動蛋白絲的錨定。

最后，為了評估LXN在體內調節內皮細胞形態的作用，對WT和LXN-/- 小鼠主動脈弓內皮細胞進行染色，觀察細胞形態變化和細胞骨架分布，結果表明，LXN在體內調節內皮細胞形態變化和肌動蛋白細胞骨架重組。接下來，評估了LXN缺失對體內血管功能的影響，數據表明，LXN敲除顯著降低了微血管的通透性。

然后進一步評估了LXN缺失在動脈粥樣硬化中的血管保護作用，實驗構建了 ApoE‐/- LXN‐/‐ 型雙基因敲除小鼠，用高脂飲食喂養小鼠16周，建立動脈粥樣硬化模型。血管舒張能力分析表明，高脂飲食極大地損害了血管舒張功能。LXN缺失不僅能逆轉高脂飲食引起的血管舒張功能障礙，還能顯著改善正常小鼠的血管舒張（圖3 A），進一步表明LXN缺失對血管的保護作用。最后，也是最重要的一點，發現LXN缺失顯著抑制了高脂飲食誘導的動脈粥樣硬化斑塊的形成（圖3 B、C）。這些結果表明，LXN缺失可以改善小鼠的血管功能，減輕動脈粥樣硬化斑塊的形成。

圖3 LXN缺失可改善HF誘導的ApoE-/- 小鼠血管舒張能力和動脈粥樣硬化。
 

圖4 靜態和層流剪切應力或LXN缺失ECs中細胞形態和應力纖維網絡的示意圖。在正常情況下，正常 ECs中的 Arp2/3、α-actinin 和 FLNA 交聯肌動蛋白絲產生橫弧。在層流剪切應力下，LXN的丟失導致FLNA的蛋白水解裂解和亞細胞定位，ECs中Arp2/3、α-actinin和paxillin的下調。結果表明，ECs從典型的鵝卵石狀排列拉長到均勻的紡錘狀排列，并顯示出F-肌動蛋白絲在細胞縱向上的分布。

綜上所述，該研究結果表明，LXN缺失對血管具有保護作用。研究數據支持LXN通過與細胞骨架蛋白形成復合物，成為ECs形態的重要調節因子。LXN在血管內皮細胞中直接與FLNA相互作用，這種相互作用是功能性的，因為LXN的缺失增強了FLNA蛋白水解裂解和亞細胞定位，它可能是生理性的，因為它抑制了肌動蛋白絲與黏著斑的錨定，并導致細胞形態變化，這與層流剪切應力對 ECs 的影響相似。重要的是，實驗發現LXN缺失可顯著改善小鼠的血管通透性、血管舒張和動脈粥樣硬化，這表明LXN缺失對血管穩態具有保護作用，為血管疾病的治療提供了新的靶點。

參考文獻：He G, Kan S, Xu S, Sun X, Li R, Shu W, Chen M. LXN deficiency regulates cytoskeleton remodelling by promoting proteolytic cleavage of Filamin A in vascular endothelial cells. J Cell Mol Med. 2021 Jul;25(14):6815-6827. doi: 10.1111/jcmm.16685. Epub 2021 Jun 3. PMID: 34085389; PMCID: PMC8278077.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34085389/

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