化學引誘受體及其同源配體是破壞腫瘤進展級聯反應的有前途的藥物靶點。大多數化學引誘受體是傳統的七次跨膜（7TM）G偶聯蛋白受體（GPCRs）^1,2。ACKRs（非典型趨化因子受體）與傳統的GPCR不同，它不激活引導細胞遷移所需的依賴于 G 蛋白的信號傳導^3,4。相反，它們通過充當清道夫受體、促進趨化因子內吞作用或產生趨化因子梯度來調節趨化因子的可用性。

C-C基序趨化因子受體樣2(CCRL2)是一種與 ACKR 家族相關的非信號轉導7TM 受體⁵。然而，CCRL2與ACKRs不同，因為它缺乏配體清除功能，也缺乏與經典趨化因子結合確認的能力。CCRL2 是一種非信號轉導受體，它能與趨化配體結合，使白細胞被招募到炎癥部位。然而，人們對直接與 CCRL2 結合的配體類型和功能影響還缺乏了解。

最近在表面等離子體共振領域技術的進步促進了在自然表達條件下配體-受體相互作用的表征。表面等離子體共振（SPR）顯微鏡結合了SPR和明場顯微鏡（圖1A）來檢測未標記分子與細胞表面目標的結合。^6-8
 

圖 1 (A)SPRM 儀器的示意圖，描繪了 SPR 和明場輸入、細胞室和樣品流。⁹（B） Chemerin 與跨膜 CCRL2 受體結合。

SPRM 測量整個細胞表面分子相互作用的動力學，對于確定配體與細胞表面表達受體的結合速率（ka）、解離速率（kd）和結合親和力（KD）至關重要。利用BI的ImageSPR™ 分析軟件，SPRM 傳感器表面被均勻地劃分為數百個興趣區域（ROI）。

在本研究中，使用BI SPRm200儀器證實，在親代 HEK 293T 細胞和變異型 HEK-huCCRL2 細胞上⁹，一種非趨化因子趨化蛋白--Chemerin與CCRL2 結合（圖 1B）。當Chemerin暴露于HEK-huCCRL2 細胞時，在細胞上觀察到大量的ROI（圖 2A），但當Chemerin暴露于親代HEK細胞時，只有少量的ROI出現（圖 2B），這表明Chemerin能特異性地結合表達CCRL2 的細胞。采用 1:1 結合模型評估Chemerin與表達 HEK-huCCRL2 細胞結合的動力學數據，顯示計算的結合速率、解離速率和結合親和力（圖 2C、D 和 E）直方圖趨于穩健高斯分布，其中檢測到Chemerin在親代HEK細胞中的結合率極低，KD 值無法計算。本研究報告了實驗中Chemerin與HEK-huCCRL2細胞結合的平均值，包括結合速率（ka = 3.11E+05 M-1 s -1 ）、解離速率（kd = 1.16E-03 s -1 ）和結合親和力（KD = 5.49 nM）。重要的是，通過 SPRM 測定的Chemerin與 huCCRL2 結合的平均 KD 與之前報道的通過放射性標記的Chemerin與過表達 huCCRL210 的細胞結合而測定的結合親和力（2.35 nM）相當¹⁰。
 

表 1 Chemerin與 HEK-huCCRL2 的結合概況

通過 SPRM，可以對一種以前未報道過的 C-C 趨化因子進行直接結合和動力學分析。研究人員測定了 Chemerin 與 HEK 293T 親本細胞以及 HEKhuCCRL2 變體細胞上的 CCRL2 的結合動力學。

CCRL2 不激活細胞內的 G 蛋白，而是將配體集中在質膜上¹¹ 。該受體的下游信號傳導機制尚不清楚，因此鑒定能中和 CCRL2 與配體結合的工具是研究其功能的主要途徑。為此，我們使用 SPRM 作為一種確證抗體結合的方法，研究兩種抗 huCCRL2 單克隆抗體（K097F7 和 152254）與 HEK-huCCRL2 細胞和親代 HEK 293T 細胞的結合動力學。在 HEK-huCCRL2 細胞上檢測到了大量的 ROI（圖 3A 和 3B），但在親代 HEK 細胞上沒有檢測到。
 

表 2 與 HEK-huCCRL2 結合的中和抗體概況

K097F7 和 152254 與 HEK-huCCRL2 細胞的結合親和力（KD）分別為 2.48 nM 和 4.75 nM（表 2），重要的是，K097F7 和 152254 與親代 HEK 細胞的最小結合導致 KD 值無法計算。此外，觀察到同型對照抗體與 HEK-huCCRL2 細胞的結合極少（圖 3C），這表明 K097F7 和 152254 與 CCRL2 是特異性結合。
 

SPRm200系統將光學顯微鏡與分子互作技術相結合，專為觀察和測量細胞膜表面蛋白和其他目標分子結合親和力及動力學常數設計，為分子相互作用的研究開辟了新的方法。
(1)SPRm200系統無需對觀察目標進行標記，可以實時定量的進行檢測；
(2)可同時可視化觀察細胞結構和局部結合活性；
(3)無需提取細胞膜蛋白，即可在正常活細胞狀態下觀察和測量藥物和膜蛋白的實時相互作用；
(4)探測器測量每個像素點的SPR響應，并將其映射到SPR圖像中，在每個像素處，記錄一個傳感圖，從而提供更多的局部信息。

SPRM技術使在自然條件下研究細胞表面膜蛋白與其他目標分子結合和相互作用成為可能。SPRm200細胞原位分子互作動態分析系統憑借其卓越的靈敏度和穩定性，助力科學研究新發現，推動藥物開發新高度。

參考文獻
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