成孔毒素是一類與細胞膜相互作用導致溶血孔的蛋白家族，對靶細胞具有致命性。在水中，蛋白質被牢固地折疊，但在與細胞膜脂相互作用時，它們成為低聚整體膜結構。毒素的結合取決于膜的結構。
 

       多參數表面等離子體共振(MP-SPR)是一種高靈敏度、無標記的研究表面變化的方法。脂質囊泡層分布在傳感器表面，測量了四種海葵放線素與脂質的相互作用。與其他兩種放線酶相比，溶血素I和II具有明顯更高的結合和成孔能力。發現脂質結構中的膽固醇增加了equinatoxin II和fragaceatoxin C的結合。
 

概述

       生物分子相互作用是藥物發現和生物傳感器開發領域的常規測量。表面等離子體共振(SPR)是一種成熟的方法，用于測量結合親和力和動力學。綜合多參數表面等離子體共振(MP-SPR)儀器可以在寬角度范圍(40-78度)和多個波長進行測量，從而使MP-SPR成為測量脂質，膜提取物和活細胞相互作用的絕佳工具。

       MP-SPR儀器的光學設置可以同時測量多個光學參數。使用PureKinetics™功能，參數的相互關系允許對干擾體信號進行簡單的在線表征，并能夠實時校正體效應。當使用改變緩沖液或不存在最佳參考表面時，例如在與脂質層或材料的分子相互作用期間，這是非常有用的。
 

材料與方法

       用洗滌劑3-[(3-膽酰胺丙基)二甲基氨]-1-丙磺酸清洗表面后，脂質囊泡附著在羧甲基葡聚糖包被的傳感器載玻片上。模型脂質系統含有1,2 -二甘油酯- sn-甘油- 3 -磷酸膽堿(DOPC)和鞘磷脂(SM)，含和不含膽固醇(Chol)。脂質囊泡作用于葡聚糖表面(0.5 mM脂質濃度)12分鐘。用50mm NaOH沖洗未結合的脂質。牛血清白蛋白(BSA)被用作阻斷分子，以防止任何非特異性結合底物。運行緩沖液為10 mM Tris, 140 mM NaCl, pH 7.4。

       研究了三種海葵產生的Equinatoxin II (EqtII)、fragaceatoxin C (FraC)、sticholysins I和II (StnI和StnII)(圖1)。4.0 μM放線素作用于脂質表面10分鐘，計算結合質量(ng/cm²)。利用CHAPS對傳感器表面進行再生。

圖1。海葵放線素(成孔毒素)與脂質膜結合導致細胞死亡。采用MP-SPR法測定Equinatoxin II (EqtII)、fragaceatoxin C (FraC)、sticholysin II (StnII)和sticholysin I (StnI)與脂質囊泡的結合。

結果和討論
 

      所選的放線酶具有非常相似的分子結構。然而，孔隙形成活動是已知的不同。根據MP-SPR測量，StnII和StnI與DOPC:SM(4:1)脂質囊泡的結合比FraC和EqtII放線素的結合高3倍以上(圖2a)。當膜中含有膽固醇(DOPC:SM:Chol, 1:1:1)時，FraC和EqtII的結合明顯增加(圖2b)。MP-SPR結果與等溫滴定量熱法(ITC)結果吻合良好(圖3)。
 

       放線酶的成孔能力與對脂質結構的親和力有關。差異是由分子前30個n端殘基的序列變化引起的。Garcia-Linares等(2016)進一步研究了sticholysins II色氨酸殘基對孔隙形成活性的影響。利用MP-SPR研究了天然和突變型膽溶素ii在不同脂質組成的膜上的結合。
 

圖2。與equinatoxin II, fragaceatoxin C (A)相比，放線素分解酶I和分解酶II在DOPC:SM(4:1)脂質體上的結合明顯更強。然而，當脂質成分中含有膽固醇時，EqtII和FraC的結合增加(B)。質量值(ng/cm²)是兩次測量的平均值。DOPC = 1,2 -二油基- sn-甘油- 3 -磷酸膽堿，SP =鞘磷脂。


圖3。采用等溫滴定量熱法(ITC)研究了StnII和EqtII與DOPC:SM囊泡的結合。ITC的結果與MP-SPR的結果非常一致。

結論

       MP-SPR為毒素相互作用機制提供了有價值的信息。小分子量或大分子量毒素的相互作用可以實時和無標簽測量。除了膜研究之外，分子與靶分子、生物材料和活細胞的相互作用也可以使用MP-SPR方法進行研究。在相互作用測量之前，可以使用MP-SPR提供的厚度和折射率信息來確定脂質的構象。