在醫學領域，技術的進步常常意味著更快、更準確的診斷和治療方法。而今，我們引領醫學進步的道路，帶來了一項革命性的技術——TIGR組織研磨分離儀，以下簡稱TG。這項技術將徹底改變我們對于細胞診斷的認識，讓醫學界邁入了一個全新的時代。

TG，是一種基于反向旋轉的機械解離裝置。通過預先編程的交替切割和研磨步驟，它能夠快速、高效地從固體組織中分離出單個活性細胞，無需使用酶類試劑。這項技術的優勢不僅在于快速，更在于保留了細胞的生物活性和形態完整性，為后續的診斷和治療提供了可靠的基礎。
 

手術期間快速準確的組織病理診斷對臨床決策至關重要。目前常用的術中咨詢病理學方法耗時、勞動力成本高，并需要受過訓練的病理學家的專業知識。

在這里，研究團隊引入了一種替代技術（快速、無標記的固體組織活檢診斷方法），通過依次評估懸浮的單個細胞的物理表型，實現了對活檢樣本進行快速、無標記的分析。該方法結合了使用TIGR組織研磨分離儀進行無酶機械解離組織，快速簡便地分離出活性單個細胞，以及使用RT–FDC對成千上萬個單個細胞的細胞物理表型進行順序評估。

這種新的診斷流程將組織的無酶機械解離與測量速率為100-1,000個細胞/秒的實時可變形細胞計數儀和基于機器學習的分析相結合。從單個細胞的明場圖像中提取的物理表型參數可以用于區分各種組織中的細胞亞群，而無需先驗知識或分子標記。此外，我們展示了我們的方法在炎癥性腸病診斷中的潛力。通過無監督的維度降低和邏輯回歸，我們準確區分了小鼠和人類活檢樣本中的健康和腫瘤組織。該方法在30 min內提供結果，為快速、無標記的診斷流程奠定了基礎，以檢測固體活檢中的病理變化，適用于術中診斷和病理變化。

這項技術的應用范圍廣泛，不僅可以用于研究領域的細胞分析，也可以在臨床診斷中大顯身手。

優勢1
TG配合RT-FDC技術先進的微流控芯片，有高速相機和智能數據處理軟件，實現實時形態學、機械和熒光參數的獲取和分析。RT-FDC技術通過實時監測細胞形態和變形，還可以通過分析細胞的變形、大小等參數,為科研人員提供了更加豐富的數據維度, 進行更加精準的診斷，甚至可以用于癌癥的早期檢測和疾病的預后評估。

優勢2
除此之外，TG還具有無酶、高通量的特點，使其在臨床應用中具備了巨大的優勢。它不僅可以用于術中診斷，還可以用于實時監測疾病的進展和治療效果，為臨床醫生提供了更加及時、精準的診斷和治療方案。
 

首先，我們篩選了不同的小鼠組織，并評估了機械解離組織后的細胞產量、存活率以及RT–FDC測量的可行性。我們展示了僅基于圖像提取的物理參數就可以區分組織細胞的亞群，而無需先驗知識或額外的分子標記，這可以增強傳統的流式細胞術。我們還展示了我們的方法可以通過在微流控系統中測量細胞變形來確定結腸組織中的炎癥變化。此外，我們還檢查了來自小鼠和人類結腸的冷凍和新鮮活檢樣本，并通過主成分分析（PCA）和機器學習對多維數據進行分析，展示了RT–FDC可以區分健康和癌變組織。這些發現表明，使用RT–FDC評估組織來源的單個細胞的物理表型是一種檢測炎癥或惡性狀態的替代策略。我們的流程可以在30 min內提供結果，并可以在不偏見和無標記的情況下識別和表征組織中的細胞群體的潛力。

結果
機械解離組織的物理表型
在評估細胞的物理表型之前，面臨的第一個挑戰是在幾分鐘的時間內快速從固體組織中提取單個細胞，同時旨在最大程度準確地代表細胞亞群的異質性。為此，我們使用了TG，這是一種基于反向旋轉的研磨齒的機械解離裝置（圖1），裝在錐形底離心管中。該裝置自動執行預定義的交替切割和研磨步驟，以從固體組織中分離出單個細胞。使用TG或常規酶解方案處理了十種不同的小鼠組織進行比較。大多數組織的存活率為70–90％；細胞產量與酶解離相似且取決于組織種類。機械解離的關鍵優勢在于處理時間不到5 min/樣本，而不是酶解方法的數十分鐘甚至幾個小時。處理速度可能有助于接近原位條件以此來保留生化和生物物理表型。
 

圖1| 物理表型分析過程示意圖

組織樣品被切割成小塊并放入含有培養基的組織研磨器內轉子中。通過預先編程的自動執行的順時針和逆時針旋轉序列進行機械解離。解離的細胞被離心并懸浮在測量緩沖液中。樣品被加載到微流控芯片上，并使用RT-FDC進行分析。對典型的大約10,000個細胞的每個單個的亮場圖像進行捕獲。從圖像中提取各種特征，用于多維分析。總的來說，從組織到結果的整個過程不到30 min。

使用組織的機械解離和基于物理表型的無標記分析時，對于肝臟這樣的特定組織，這種方法是否能夠真實地代表組織中存在的細胞類型的分布進行了仔細研究。在小鼠肝組織解離后，通過細胞形態和大小測量，確定橫截面細胞面積大于150平方微米的細胞為肝細胞。肝細胞是肝臟的主要實質細胞，占肝細胞總數的70％，近80％的肝臟體積。使用TG獲得的細胞懸液中，肝細胞占總細胞的平均比例為52.5％，通過機械解離獲得的細胞懸液中與酶解消化相比更接近組織中的真實比例。利用細胞大小識別不同的肝細胞亞群，這些亞群與不同倍性的肝細胞相關聯。

在RT-FDC測量中，數百個單個細胞懸浮在高粘度的甲基纖維素緩沖液中，經過微流控通道狹縮。在這個過程中，細胞受到剪切應力和壓力梯度的影響，導致其變形，并且每個細胞的圖像被獲取。通過實時計算圖像中的幾個物理參數，包括細胞的變形、大小、亮度、亮度標準差、長寬比和面積比。此外，通過熒光模塊檢測細胞表面標記的表達情況。

圖2展示了從肝臟、結腸和腎臟中提取的細胞的物理參數分布示例。每個聚類代表具有相似物理表型和表面標記表達的細胞組成的群體。通過圖像派生的物理參數，例如細胞大小和平均亮度，可以純粹地區分出上皮細胞群體，而無需使用額外的熒光抗體面板。在結腸上皮細胞中，可以根據亮度和大小確定多個細胞聚類。在腎臟的白細胞群體中，也可以基于細胞大小和變形參數找到不同的聚類。
 

圖2| 小鼠肝臟、結腸和腎臟樣本細胞物理參數的說明性散點圖

a，從肝臟分離的細胞的平均亮度與細胞大小的代表性散點圖，顯示大量細胞簇。標記的細胞群（形成細胞大小為 25-50 μm2 且亮度平均值在 100-115形成了一個明顯的簇）富含 EpCAM 陽性（上皮）細胞，但不含 CD31 陽性（內皮）細胞或 CD45 陽性細胞（白細胞））。FITC，異硫氰酸熒光素；PE、藻紅蛋白；APC，別藻藍蛋白。b，EpCAM 和 CD45 細胞表面標記染色的結腸細胞的說明性散點圖。在 EpCAM 陽性群體中，可以根據物理參數（例如亮度和細胞大�。┑拿芏葓D可以區分7個細胞亞群。c，EpCAM 和 CD45 染色的腎細胞的說明性散點圖。在 CD45 群體中，根據細胞大小和變形的相似性確定了4個亞群。散點圖中的顏色圖表示事件密度。

RT–FDC還可用于捕獲細胞相互作用。使用長寬比和細胞大小參數，我們在胸腺、脾臟和腎臟樣本中確定了細胞雙體。許多雙體由兩種不同的細胞類型組成，根據細胞表面標記來判斷（圖3）。通道內的細胞位置與熒光峰的位置相結合，使我們能夠確定，例如，雙體由白細胞（CD45+）和內皮細胞（CD31+）組成。使用RT–FDC排序模塊，可以無標記地分離細胞雙體進行進一步的分子分析和下游應用，包括對組織中相互作用的免疫細胞進行研究。
 

圖3| 使用RT-FDC檢測細胞二聚體

代表性的細胞從小鼠a胸腺，c脾臟和e腎臟 分離的細胞大小與縱橫比的散點圖，顯示了識別細胞二聚體的門控策略。在b胸腺和d脾臟中鑒定的細胞二聚體及f腎臟中的對應熒光跡線（b、d），顯示了白細胞（CD45）與內皮細胞（CD31）相連接，或（f）兩個白細胞的相互作用。

人組織制備
從埃爾蘭根病理學研究所獲得的腫瘤或健康組織手術切除的人類活檢樣本，立即置于含有10% 胎牛血清（FBS）、1% GlutMAXTM、1% HEPES和1% 青霉素/鏈霉素的DMEM Advanced培養基中，并存放在4 °C下，立即處理或在液氮中冷凍以備后用。

組織解離和單細胞制備
使用TissueGrinder（TG）進行組織解離。簡單地說，將組織樣本切成約1-2 mm大小的小塊，并放入800μL含有2% FBS的DMEM于TG的轉子中。將轉子單元放置在一個50 ml離心管的蓋子中，帶有100 μm細胞篩的定子插入到轉子的頂部。將50 ml離心管放置在蓋子上，旋緊并放置在TissueGrinder設備上（見圖1）。每種組織類型的研磨過程參數總結在表1中。在研磨過程之后，將離心管倒置到架子上，打開，并用5 ml DMEM，2% FBS沖洗細胞過濾器。流過物被轉移到15 ml離心管中，并在300 g離心8 min。然后抽取上清液，將細胞沉淀用2 ml PBS(含2% FBS)洗滌，通過帶有細胞過濾器蓋的FACS管，并在300 g離心5 min。將細胞沉淀懸浮在高粘度測量緩沖液中，該緩沖液由稀釋在無鈣鎂磷酸鹽緩沖液（PBS）中的0.6%（w/w）甲基纖維素（4,000 cPs; Alfa Aesar）制備而成。
 

表1：用于機械解離的小鼠器官和相應的TG方案流程，以及用于RT-FDC測量的微流控芯片大小

通過細胞的物理表型來鑒定組織炎癥
炎癥性腸病（IBD），如克羅恩病和潰瘍性結腸炎，是與受損的上皮/黏膜屏障以及免疫細胞的激活/招募相關的腸道慢性炎癥性疾病。盡管IBD的病因尚未完全理解，但我們對IBD的理解很大程度上來自實驗動物模型的研究。其中一種模型是將原始T細胞轉移入Rag1缺陷小鼠中誘導實驗性結腸炎（慢性結腸炎的T細胞轉移模型，以下簡稱轉移性結腸炎）。然后通常通過來自結腸組織的用伊紅染和伊妥珠染的切片生成的組織病理學評分來量化其嚴重程度。

在轉移性結腸炎動物模型中對結腸細胞的物理表型變化進行的調查。通過細胞的變形與大小的散點圖（見圖4），發現疾病組織中的細胞似乎比健康組織中的細胞變形較小。在檢查CD45+細胞后，發現轉移性結腸炎樣本中存在大量變形較小的白細胞，可能是淋巴細胞�？傮w上，轉移性結腸炎樣本的中位數變形顯著減少，并且伴隨著白細胞百分比的顯著增加，符合淋巴細胞的浸潤。細胞的中位數變形與白細胞百分比呈強烈的負相關。此外，細胞大小和變形的中位數值與專家的組織病理學評分相關。值得注意的是，健康組織比患病組織更難機械分離成單個細胞，患病組織產生了更多的分析事件。

我們觀察到，在炎癥期間細胞的物理表型發生變化，加上越來越多的證據表明慢性炎癥與惡性腫瘤相關，這導致我們推測我們的方法可能會檢測到腫瘤活檢樣本的變化。我們證實了這種可能性，對于小鼠和人類樣本都是如此。

圖4| 通過 RT-FDC 進行的細胞物理表型反映了組織炎癥

a，與健康小鼠結腸組織（對照）相比，從轉移結腸炎組織樣本（TC）分離的細胞的細胞大小與形變散點圖；具有相應的細胞大小和變形直方圖。
b，對相同的兩個結腸樣本進行CD45陽性細胞門控，顯示轉移結腸炎樣本中白細胞的富集，并伴隨著物理表型參數的變化。散點圖中的顏色圖表示事件密度。
c，a 和 b 中所示樣本的核密度估計圖，其中等高線標記為 0.5（淺色陰影，外輪廓）和 0.95（深色陰影，內輪廓）水平。
d， 中值變形和CD45陽性細胞百分比的量化（三個獨立實驗中n = 14只生物學獨立的動物）。方框從第 25 個百分位延伸到第 75 個百分位，中間有一條線；晶須跨越 1.5 倍四分位距。使用雙邊Mann-Whitney U檢驗進行統計比較。
e，所有細胞變形中值與白細胞（CD45+細胞）比例的雙邊Pearson相關性；P = 0.0065和r = −0.69。

區分小鼠結腸中的腫瘤組織與健康組織
我們的研究發現，腫瘤組織中的細胞的機械特性與對照樣本顯著不同，表明我們的方法在檢測結直腸癌方面具有潛力。圖5a-c中單個小鼠的代表性圖表顯示，腫瘤中的細胞與其健康對應物相比，細胞大小更大，變形更高。對所有32個樣本的分析表明，腫瘤中的細胞具有顯著較高的平均細胞大小、變形和面積比，效應大小從中等到強（圖5d、e和g）。腫瘤樣本還表現出更大的異質性，如圖5c中廣泛的分布以及細胞大小和面積比的標準偏差顯著增加（圖5d和g）。
 

圖5 | 小鼠結腸組織中腫瘤和健康組織細胞的物理表型分析

研究團隊在驗證他們的方法在不同器官組織上的有效性時所采取的步驟和結果。他們將方法應用于來自9名癌癥患者的新鮮切除的肺活檢樣本，并使用主成分分析（PCA）結合邏輯回歸來區分健康樣本和腫瘤樣本。結果顯示，他們的方法能夠很容易地將7個健康樣本與7個腫瘤樣本分開，并且進一步正確分類了4個盲樣本。在PCA中，PC1和PC2解釋了46.9%的方差，其中變形參數對PC1有很大的貢獻，表明細胞可變形性測量所帶來的獨特信息對于區分腫瘤和健康組織是有用的。此外，研究團隊還測試了他們的方法對于只存在少量癌細胞的情況的敏感性，如低腫瘤細胞度和廣泛的成纖維性腫瘤基質含量的腫瘤，或者經過化學或放射化療后幾乎完全緩解的腫瘤。他們的方法成功地將一個由50%健康和50%腫瘤組織組成的樣本分類為腫瘤樣本，即使在存在極少量癌細胞的情況下，也能正確地分類樣本為腫瘤。

參考文獻：Rapid single-cell physical phenotyping of mechanically dissociated tissue biopsies | Nature Biomedical Engineering

我司將致力于將這項革命性的技術帶給更多的醫療機構和患者。我們相信，組織研磨分離儀將成為未來醫學領域的重要工具，為人類健康事業作出更大的貢獻。

讓我們攜手邁入醫學技術的新時代，讓組織研磨分離儀成為醫學界的強大助力！