Arrayjet芯片點樣儀助力蜱傳腦炎病毒檢測
蜱傳腦炎，是一種由蜱傳腦炎病毒（tick-borne encephalitis virus，TBEV）引起的，經蜱蟲傳播的傳染病，呈現各種神經系統病癥，目前尚無特效療法。其診斷主要依賴于TBEV抗體檢測，如酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent ascept， ELISA）和免疫熒光試驗（immunofluorescence assay， IFA）。然而，蜱傳腦炎病毒所屬的正黃病毒屬內有很多病毒都存在高度交叉反應，導致TBEV抗體檢測的結果有偏差，例如檢測中出現西尼羅河病毒（ West Nile virus ，WNV）的假陽性結果。因此急需找到一種高靈敏性和強特異性檢測TBEV的方法。
來自荷蘭國家公共衛生與環境研究所傳染病控制中心的團隊，于2024年2月在《Viruses 》上發表了這篇文章。該研究利用蛋白微陣列芯片技術，改進了檢測TBEV的方法。
TBEV病毒所屬的正黃病毒屬，其序列相對保守，是一個含有約11000個堿基的正鏈RNA病毒，有3個結構蛋白：C，prM和E蛋白，以及7種非結構蛋白：NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5。E蛋白包含EDI、EDII和EDIII三個結構域（圖1 ）。作者在之前的研究中，使用重組NS1（rNS1）蛋白檢測基于NS1多重蛋白微陣列中的抗正黃病毒IgG。通過多重微陣列方法，使用少量樣本體積（例如 10 μL 血清）就能快速、高通量同時檢測針對多種病毒蛋白的抗體。本文，作者進一步優化，在NS1抗原旁邊添加了EDIII抗原，提高了檢測TBEV IgG的靈敏度和特異性。
TBEV病毒所屬的正黃病毒屬，其序列相對保守，是一個含有約11000個堿基的正鏈RNA病毒，有3個結構蛋白：C，prM和E蛋白，以及7種非結構蛋白：NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5。E蛋白包含EDI、EDII和EDIII三個結構域（圖1 ）。作者在之前的研究中，使用重組NS1（rNS1）蛋白檢測基于NS1多重蛋白微陣列中的抗正黃病毒IgG。通過多重微陣列方法，使用少量樣本體積（例如 10 μL 血清）就能快速、高通量同時檢測針對多種病毒蛋白的抗體。本文，作者進一步優化，在NS1抗原旁邊添加了EDIII抗原，提高了檢測TBEV IgG的靈敏度和特異性。
圖1 正黃病毒屬基因組與實驗中構建的EDIII/rNS1基因載體示意圖
- 實驗方法
1.制備蛋白微陣列芯片
將TBEV、WNV、ZIKV（寨卡病毒）、USUV（烏蘇圖病毒）、JEV（日本腦炎病毒）、EDNV（登革熱病毒）的EDIII和NS1蛋白，利用英國Arrayjet公司的Marathon系列生物芯片點樣儀（新型號Mercury系列）制備成蛋白微陣列芯片。
2.血清樣本與蛋白微陣列芯片雜交孵育
感染過或疑似感染過DENV、ZIKV、WNV、USUV、TBEV的患者血清，陰性血清分別與蛋白微陣列芯片雜交孵育，并用芯片掃描儀獲取雜交結果。
3.蝕斑減少中和試驗（Plaque Reduction Neutralization Test ，PRNT）
將上述血清與病毒混合后孵育，然后加入預先形成的A549單層細胞中，觀察并計數斑塊形成情況。同時與蛋白微陣列芯片雜交結果比較。
將TBEV、WNV、ZIKV（寨卡病毒）、USUV（烏蘇圖病毒）、JEV（日本腦炎病毒）、EDNV（登革熱病毒）的EDIII和NS1蛋白，利用英國Arrayjet公司的Marathon系列生物芯片點樣儀（新型號Mercury系列）制備成蛋白微陣列芯片。
2.血清樣本與蛋白微陣列芯片雜交孵育
感染過或疑似感染過DENV、ZIKV、WNV、USUV、TBEV的患者血清，陰性血清分別與蛋白微陣列芯片雜交孵育，并用芯片掃描儀獲取雜交結果。
3.蝕斑減少中和試驗（Plaque Reduction Neutralization Test ，PRNT）
將上述血清與病毒混合后孵育，然后加入預先形成的A549單層細胞中，觀察并計數斑塊形成情況。同時與蛋白微陣列芯片雜交結果比較。
- 實驗結果
NS1蛋白微陣列芯片結果呈現屬內高度交叉反應
在NS1的蛋白微陣列芯片雜交結果中，所有的陰性血清都無免疫特異反應。來自感染過或疑似感染過上述病毒的患者血清雜交實驗中，大部分血清都和相關抗原出現了免疫陽性結果，而且這些患者血清同時與屬內其他病毒出現了陽性反應，這與此前報道的正黃病毒屬內有很多病毒都存在高度交叉相一致。
免疫學檢測金標準--PRNT的實驗結果顯示，NS1蛋白微陣列結果中出現的陽性結果在PRNT中都為陽性。在20例TBEV的患者血清實驗中，除了蛋白微陣列芯片已經確認的7例之外，還有8份血清也呈現陽性。說明單獨檢測NS1抗原存在假陰性結果，因此基于NS1抗原的蛋白微陣列流程需要進一步優化。
TBEV EDIII的蛋白微陣列實驗結果
為了提高蛋白微陣列檢測的靈敏性和特異性，使用EDIII陽性血清（來自接種TBEV疫苗志愿者）和上述血清再次與EDIII蛋白微陣列芯片雜交。結果顯示，之前的20份TBEV患者血清 EDIII雜交結果與PRNT結果完全一致——15份血清為陽性，5份為陰性。而這些血清樣本對WNV、DENV、ZIKV、USUV 和 JEV 的IgG反應水平則比較低。這說明EDIII的確存在屬內交叉反應，但TBEV的反應水平則遠高于其他病毒。
在NS1的蛋白微陣列芯片雜交結果中，所有的陰性血清都無免疫特異反應。來自感染過或疑似感染過上述病毒的患者血清雜交實驗中，大部分血清都和相關抗原出現了免疫陽性結果，而且這些患者血清同時與屬內其他病毒出現了陽性反應，這與此前報道的正黃病毒屬內有很多病毒都存在高度交叉相一致。
免疫學檢測金標準--PRNT的實驗結果顯示，NS1蛋白微陣列結果中出現的陽性結果在PRNT中都為陽性。在20例TBEV的患者血清實驗中，除了蛋白微陣列芯片已經確認的7例之外，還有8份血清也呈現陽性。說明單獨檢測NS1抗原存在假陰性結果，因此基于NS1抗原的蛋白微陣列流程需要進一步優化。
TBEV EDIII的蛋白微陣列實驗結果
為了提高蛋白微陣列檢測的靈敏性和特異性，使用EDIII陽性血清（來自接種TBEV疫苗志愿者）和上述血清再次與EDIII蛋白微陣列芯片雜交。結果顯示，之前的20份TBEV患者血清 EDIII雜交結果與PRNT結果完全一致——15份血清為陽性，5份為陰性。而這些血清樣本對WNV、DENV、ZIKV、USUV 和 JEV 的IgG反應水平則比較低。這說明EDIII的確存在屬內交叉反應，但TBEV的反應水平則遠高于其他病毒。
- 實驗結論
正黃病毒屬內病毒在血清學檢測中的確存在高度交叉性，PRNT實驗驗證了這一結論。通過在蛋白微陣列芯片中聯合使用TBEV NS1和EDIII抗原蛋白，可以提高TBEV檢測的靈敏性和特異性，有助于在感染早期快速發現TBEV感染，爭取治療的窗口期。
更多內容請閱讀原文：https://doi.org/10.3390/v16020286
Arrayjet位于英國愛丁堡，專注于提供生物芯片應用領域的解決方案及服務。自2000年公司成立即致力于開發新型生物樣品噴點方案–噴墨式液體處理平臺，該系統于2006年上市，目前用戶遍布全球27個國家。
Mercury系列產品采用獨特的飛行噴墨點樣技術實現行業第一的快速、非接觸式微量液體處理。同時上萬種不同樣品可以進行快速點樣，專利的上樣模塊配合高通量的點樣噴頭保障您的點樣操作快速、無污染，更低的上樣體積可有效減少樣品損失，使您的珍貴樣品物盡其用。
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