線粒體移植技術綜述及其在體外、體內和臨床的應用前景
圖 1. 線粒體移植技術[1]。
線粒體移植 (MT, Mitochondrial transplantation) 是指將分離獲得的線粒體注射到組織器官的受損部位，或者注射到血液循環系統，從而發揮療效的技術。在細胞水平上，則是指將分離獲得的線粒體轉移至靶細胞，來研究線粒體移植效果的技術。
Tips：為什么要進行線粒體移植？
1) 外源線粒體進入到生理環境中的細胞后，將提高細胞能量供應、促進細胞存活；但線粒體進入到缺氧和酸性的腫瘤組織后，將大量產生氧自由基、誘發細胞死亡。線粒體這種環境響應性的藥理特性，可應用于清除腫瘤細胞、恢復受損組織的功能。
2) 1982 年，Clark 和 Shay 研發出了第一種將異種來源的線粒體移植到另一個細胞中的方法。2007 年，從大鼠細胞中分離出的線粒體被成功整合到受損的人類間充質干細胞 (Mesenchymal stromal cells, MSCs) 中，改善了代謝功能。此后，大量研究表明，線粒體可以整合到細胞中發揮作用。
3) 近年來，該技術在體外、體內和各種臨床應用中展現出良好的應用前景，具有防止細胞死亡、減少炎癥、恢復細胞代謝和適當的氧化平衡等益處。
小小能量站:
血管里布滿了內皮細胞，它們對血管的形成和血液的流動至關重要。為了治療缺血性疾病，將內皮細胞移植到血管阻塞部位附近，以促進血管的形成并恢復血液流向組織。
然而，這種療法的一個相當大的局限性是內皮細胞 (Endothelial cells, ECs) 必須與未分化的干細胞 (間充質基質細胞, Mesenchymal stromal cell, MSCs) 共同移植 (間充質基質細胞支持組織修復和再生)。
目前為止，基質細胞促進內皮細胞移植的機制尚不清楚。近期，Nature 報道了一種創新的移植策略來幫助修復缺血組織。Lin 和他的同事發現基質細胞將線粒體轉移到內皮細胞，這些線粒體在轉移后被降解，促使內皮細胞產生自己的新線粒體。
該研究表明，人工將線粒體移植到內皮細胞中以模擬這種自然轉移，可以通過移植的內皮細胞刺激血管的形成 (圖 1)。
圖 1. 線粒體細胞器的轉移促進了血管的形成[2]。
為了在因血液供應不足 (缺血) 而受損的組織中生長新的血管，可以將排列在血管壁上的內皮細胞移植到受損的組織中。然而，這些細胞只有在與稱為間充質基質細胞的干細胞共移植時才能成功形成新血管，這是該療法的一個相當大的并發癥。(a) Lin 等人 發現基質細胞通過被稱為納米管的細胞突起將一些線粒體轉移到內皮細胞。轉移的線粒體被 PINK1 和 Parkin 蛋白迅速標記為降解，這刺激了新線粒體的產生 (生物發生)，增強了內皮細胞的功能。(b) 為了模擬自然的線粒體轉移，作者將從基質細胞中分離的線粒體人工移植到內皮細胞中，發現這些線粒體促進的內皮細胞移植物是可行的，并且在不需要基質細胞的情況下刺激血管的形成。▐ 新機制：MSCs 通過線粒體轉移促進 EC 的植入
首先，Lin 等人在存在或不存在支持基質細胞 (MSCs) 的情況下將人內皮細胞 (ECs) 移植到小鼠皮膚下。并證實，只有共移植的移植物才有形成功能性血管的內皮細胞 (圖 2)。在過去的十年中，基質細胞已被證明可以自然地將線粒體轉移到其他類型的細胞，線粒體轉移已被證明可以促進因缺血而受損的組織的再生。
圖 2. 基質細胞對人 ECs 的移植至關重要[3]。
在免疫缺陷裸鼠皮下植入含有或不含 MSCs 的人內皮細胞移植物。7 天的人ECFCs (Endothelial colony-forming cells, 內皮集落形成細胞), HUVECs (Human umbilical vein endothelial cells, 人臍靜脈內皮細胞)和 wat-ECs (White-adipose-tissue-derived ECs,白色脂肪組織來源的內皮細胞)的H&E 染色，突出灌注血管 (黃色箭頭)。為了研究基質細胞 (MSCs) 的線粒體轉移是否可以介導移植過程中內皮細胞 (ECs)的存活。作者用一種名為 DsRed 的熒光蛋白標記了基質細胞中的線粒體。
觀察到 DsRed 標記的線粒體位于長長的突起物 (稱為納米管, Tunnelling nanotubes,TNTs) 中，這些突起物從基質細胞延伸出來并與內皮細胞直接接觸。24 h 后，可以在新血管內壁的內皮細胞內看到 DsRed 標記的線粒體 (圖 3)。
圖 3. MSCs 通過線粒體轉移促進 EC 的植入[3]。
(a) 注射 ECs 和 mitoRed-MSCs 的小鼠示意圖，下圖為帶有 DsRed+ 的 TNTs。(b) 免疫熒光技術鑒定帶有 DsRed+ 線粒體的 ECs (mitoRed-ECs)。然而，線粒體的轉移出人意料地短暫：它在聯合移植后立即開始，并在血管穩定后停止。此外，選擇性阻斷納米管的形成會破壞線粒體的轉移并損害血管形成。這些發現表明，線粒體通過納米管（TNTs）的瞬時轉移是 MSCs 支持 ECs 移植物活力的方式。
▐ 外源線粒體人工移植到 ECs 中是否可以增強其植入？
由于當前治療缺血的方法的局限性，作者想知道用線粒體人工啟動內皮細胞是否可以模擬聯合移植的效果。為此，作者將從基質細胞中分離出來的線粒體與 ECs 一起孵育，這樣線粒體就可以通過一種稱為內吞作用的過程被吸收，實現線粒體的人工移植 (稱為 mitoAT-EC) (圖 4a)。
圖 4. 外源線粒體移植促進 ECs 植入[3]。
(a) 線粒體分離和移植過程示意圖。(b) Seahorse 分析顯示移植后 24 h mitoAT-ECs的呼吸增強(n=6)。OCR: Oxygen consumption rate,耗氧率; OM, Oligomycin，寡霉素; FCCP，Carbonyl cyanide-p-trifluoromethoxyphenyl hydrazone，羰基氰化物-對三氟甲氧基苯腙; R&A，rotenone andantimycin A，魚藤酮和抗霉素。(c) Seahorse 分析產生 ATP。(d) ECs 與 mitoAT-ECs 的功能比較: H2O2 暴露后 ATP 生成。(e) 小鼠移植 ECs 或 mitoAT-ECs 結果圖示。這種人工線粒體移植復制了自然轉移過程，受體內皮細胞的代謝活性增強 (圖 4b-d)。在糖尿病裸鼠的缺血后肢模型中，mitoAT-EC 的植入水平顯著提高，可有效改善血流并防止組織壞死 (圖2i-p)。線粒體移植對 ECs 的增強功能可能并不直接依賴于線粒體的功能性。
▐ 外源線粒體移植誘導 mitoAT-EC 細胞自噬
從基質細胞轉移過來的線粒體不需要有增強內皮細胞移植物的功能，因為轉移過來的線粒體在一個叫做線粒體自噬的過程中迅速降解，而不是與現有的線粒體池融合。
作者在內皮細胞的自噬體中觀察到人工移植的線粒體，但是當他們通過沉默編碼 PINK1 或 Parkin 的基因表達來破壞線粒體自噬時，這阻止了線粒體被這些囊泡吞沒，即在受體內皮細胞中沉默 Parkin (由 PRKN 編碼) 可以消除 mitoAT-EC 中LC3B+ 自噬體的形成 (圖 5a-b)。
圖 5. 外源線粒體移植誘導 mitoAT-EC 細胞自噬[3]。
(a) 免疫熒光顯示移植 24 h 后 mitoAT-EC 中外源性 DsRed+ 線粒體 (紅色 )與內源性 Parkin (Alexa 647) 共定位 (白色箭頭)。(b) mitoAT-EC 中 LC3B+ 自噬體的免疫熒光檢測。Parkin 和 PINK1 沉默 (shRNA) 對供體 MSC 線粒體 (mito) 或受體 EC 的影響，DAPI 為細胞核。(c) 沉默 PINK1 和 PRKN 對間充質干細胞共植內皮細胞植入能力的影響: 第7天血管灌注移植物 (箭頭) 的觀察和 H&E 染色。(d) 圖中顯示 Parkin (受體 ECs) 和 PINK1(供體線粒體)在 mitoAT-ECs 中自噬激活中的作用。
同時，當使用 shPRKN-ECs 或 shPINK1-MSCs 時，含有 ECs 和 MSCs 的移植物在第 7 天的血管形成明顯減少 (圖 5c)。值得注意的是，線粒體自噬誘導受體內皮細胞產生新的線粒體 (線粒體生物發生)，從而增強細胞功能并刺激血管形成。在機制上，這些結果證實了 PINK1-Parkin 途徑介導線粒體自噬，而線粒體自噬反過來調節線粒體移植后 mitoAT-EC 所表現出的增強的植入能力 (圖 5d)。
這項研究揭示了細胞應激條件下的線粒體轉移機制，體外人工線粒體移植可以有效提高 ECs 在缺血組織中的移植能力，從而形成新的血管，并且線粒體移植不依賴于其他細胞類型，大大降低了臨床轉化的難度，具有重要的研究意義。
| Mdivi-1 Mdivi-1 是一種有效的線粒體分裂/線粒體自噬 (mitophagy) 抑制劑。 |
| AICAR 阿卡地新 AICAR (Acadesine) 是一種腺苷類似物，也是一種 AMPK 激活劑。AICAR 調節葡萄糖和脂質的代謝，并抑制促炎細胞因子和 iNOS 的產生。AICAR 也是一種自噬 (autophagy)，YAP 和 mitophagy 抑制劑。 |
| Adezmapimod Adezmapimod 不抑制 JNK 活性，是一種自噬 (autophagy) 和線粒體自噬 (mitophagy) 激活劑。 |
| Olaparib Olaparib 是一種自噬 (autophagy) 和線粒體自噬 (mitophagy) 激活劑。 |
| CCCP CCCP 是氧化磷酸化 (OXPHOS) 解偶聯劑。CCCP 誘導 PINK1 激活，促進 Parkin 在 Ser65 位點磷酸化。 |
| Salinomycin Salinomycin 是 Wnt/β-catenin 信號傳導的有效抑制劑，阻斷 Wnt 誘導的 LRP6 磷酸化。 FCCP FCCP 是線粒體中氧化磷酸化 (OXPHOS) 解偶聯劑。FCCP 誘導 PINK1 激活，促進 Parkin 在 Ser65 位點磷酸化。 |
[1] Main EN, et al. Mitochondria as a therapeutic: a potential new frontier in driving the shift from tissue repair to regeneration. Regen Biomater. 2023 Aug 12;10:rbad070.
[2] Evans CS. Cells destroy donated mitochondria to build blood vessels. Nature. 2024 May;629(8012):539-541.
[3] Lin RZ, et al. Mitochondrial transfer mediates endothelial cell engraftment through mitophagy. Nature. 2024 May;629(8012):660-668.
