伴隨著免疫學、細胞生物學和病毒學等學科的發展以及細胞制造和基因工程技術的進步使得免疫細胞治療各疾病的研究取得了令人振奮的進展，該進展也使免疫細胞療法從研究機構小規模研究的治療方法一躍成為全球企業開發的焦點。基因工程和臨床規模的基因編輯技術的快速發展以及相關藥企的投資，使免疫細胞療法在當今以及未來幾十年內對人類健康產生重大的影響。免疫細胞療法利用患者自身的免疫系統對抗疾病，而免疫細胞(如T細胞、B細胞、NK細胞、巨噬細胞等)的基因工程改造是免疫細胞療法的先決條件。例如在CAR-T治療中，患者的T細胞在體外被進行基因改造表達腫瘤相關抗原受體，從而使CAR-T細胞能夠在患者體內靶向殺傷特定的癌細胞。

免疫細胞基因編輯技術的關鍵步驟是需要將細胞外源物質（DNA\RNA\RNP等）導入到細胞內從而實現相關的基因編輯，然而目前該技術的挑戰在于使用傳統的病毒轉染方法存在傳統的病毒轉染方法存在引起宿主的免疫反應導致療效降低以及生物安全等問題，而電穿孔轉染技術具備無毒性、效率高等特點繞過了傳統轉染方法的潛在缺陷，因此電轉染技術在生物醫學研究中得到了廣泛應用。做為在細胞轉染和融合領域擁有超過二十年的研究經驗的NEPA GENE公司來說，其代表產品NEPA21高效基因轉染系統自上市以來備受國內外眾多用戶的青睞。在免疫細胞轉染方面，NEPA21均被研究者們用于轉染實驗中，積累了豐富的轉染條件、產品應用等寶貴的經驗和數據。以下列舉的是近年來科研人員使用NEPA21在免疫細胞轉染的部分案例：

案例1 使用NEPA21電轉人NK細胞

參考文獻：Ng Y Y, Du Z, Zhang X, et al. CXCR4 and anti-BCMA CAR co-modified natural killer cells suppress multiple myeloma progression in a xenograft mouse model[J]. Cancer Gene Therapy, 2022.

轉染物質：CXCR4 mRNA

電轉參數：穿孔電壓240V,脈沖長度2ms，脈沖次數1次

多發性骨髓瘤（Multiple myeloma, MM）是一種以骨髓漿細胞克隆擴增和免疫球蛋白異常積聚為特征的B細胞腫瘤，以溶解性骨病為標志。近年來，嵌合抗原受體（CAR）細胞療法已成為一種新的治療MM的方法，而在CAR細胞治療MM的潛在靶點中，B細胞成熟抗原（BCMA）是一個理想的靶點。目前的BCMA特異性CAR細胞療法使用來自患者的自體T細胞或NK細胞，而NK細胞轉運到骨髓依賴于CXCR4的表達，CXCR4是一種趨化因子受體，與骨髓表達小眾的趨化因子CXCL12/SDF-1α結合。

基于此，在該研究中為了產生表達CXCR4的NK細胞，將0.2ml的擴增后的10⁷個NK細胞與10μg CXCR4 mRNA混合，使用NEPA21電轉儀在2mm電轉杯中進行電轉染，下游實驗電轉染方法也被用于在NK細胞上表達抗BCMA CAR受體。電轉染后檢測檢測CXCR4分子的表達情況，結果顯示：模擬NK細胞和經CXCR4WT RNA電穿孔的NK細胞在細胞遷移方面無顯著差異（P=0.159，圖1C）。進一步證明，CXCR4R334X mRNA和CXCR4WT mRNA的電穿孔不影響NK細胞的細胞溶解功能，并且兩種類型的CXCR4修飾的NK細胞能夠像模擬電穿孔的NK細胞一樣有效地溶解K562細胞（圖1D）。接下來，作者也測試了CXCR4r334x修飾的NK細胞會更有效地遷移到NSG小鼠的骨髓腔室（圖1E）。結論是體外擴增NK細胞中CXCR4的過表達可有效促進其向骨髓遷移。

圖1.通過mRNA電穿孔過表達CXCR4R334X可提高NK細胞的遷移和歸巢能力（A:在NK細胞體外擴增前后，用CXCR4WT mRNA或CXCR4R334X mRNA電穿孔（電穿孔后8h）后，分析CXCR4在NK細胞中的表達D:轉染mRNA的NK細胞對K562細胞株的細胞毒性實驗，證明電穿孔對NK細胞的細胞毒性沒有影響。

在后續電轉實驗中，作者提到電轉后NK細胞的活力70-80%，其中約90%的NK細胞被轉染以表達CARs（圖2）。

圖2.電轉后，NK細胞的存活率為70—80%，轉染效率為90%

案例2基于CRISPR/cas9的基因編輯法使用NEPA21電轉染人的T細胞

參考文獻：Ito Y, Inoue S, Nakashima T, et al. Epigenetic profiles guide improved CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in human T cells[J]. Nucleic acids research, 2024.

轉染物質：RNP復合物

電轉參數：穿孔脈沖：電壓275V，脈沖時長1ms，脈沖間隔50ms，脈沖2次，衰減率10%，極性+；轉移脈沖：電壓20V，脈沖時長50ms，脈沖間隔50ms，脈沖5次，衰減率40%，極性+/-。

在免疫細胞過繼免疫治療中，對特定基因進行基因修飾是增強抗腫瘤免疫細胞功能的有效手段。目前CRISPR/Cas9技術的進展使得在體外制備輸注的T細胞產品時，可通過瞬時轉染RNP實現基因敲除。然而選擇最佳的gRNAs仍是有效基因敲除的主要挑戰。在本實驗中作者利用人類T細胞中CRISPR/Cas9介導的基因敲除的匯總數據探索了一種選擇最佳gRNA的方法。作者使用了高通量測序（ATAC-seq）法從轉座酶及染色質中獲得的培養T細胞的表觀遺傳譜數據，將表觀遺傳信息與基于序列的預測工具相結合，顯著提高了基因編輯效率（圖1）。并且進一步證明，通過在相鄰區域設計兩個gRNA，可以靶向表觀遺傳封閉區域。該實驗證明了通過IL-7預處理可以提高未活化T細胞的基因編輯效率。這些發現使得在人類T細胞中進行更有效的基因編輯成為可能。

圖1.基于ATAC-seq與IL-7的預處理，顯著提高T細胞的基因編輯效率。

由于病毒轉染方法獲得的數據已經構建了許多用于設計gRNA的預測工具，但尚不確定這些發現是否適用于電轉染RNP的情況。因此在研究CAR-T細胞的基因工程中，作者利用Cas9-gRNA RNP復合物的瞬態電穿孔來增強其功能，在T細胞激活后5天內，使用NEPA 21電穿孔器（NEPA GENE）將核糖核蛋白復合物（RNP）進行電穿孔到T細胞中。48-72h后，提取基因組DNA,通過PCR擴增含有目標位點的基因組區域，并將擴增子進行Sanger測序。使用CRISPR編輯推斷（ICE）分析計算每個gRNA的編輯效率。使用Indel百分比來評估CRISPR/Cas9介導的基因編輯效率（使用TYE 563標記的RNA去判斷RNP復合物的轉染效果）。采用電轉染方法，作者積累了205個gRNA針對110個基因的Indel百分比數據，發現效率在不同的靶位點之間變化很大（圖2A）。

圖2A.CRISPR/ cas9介導的人類T細胞基因編輯效率的gRNA設計算法的驗證,分別用Cas9-gRNA復合物電穿孔T細胞，分析基因編輯效率（n = 205個靶標）。

采用同樣的電穿孔參數，將TET2（圖3B）、DOT1L（圖3D）和PRDM1（圖3F）敲除時可增強T細胞早期記憶表型的維持，并計算Indel百分比。

圖3.(A)gRNA設計在兩個近端區域；兩個gRNA單獨或聯合電穿孔TET2 (B)、DOT1L(D)和PRDM1(F)時，計算Indel百分比

為了研究了組成性表達的Cas9和gRNA是否最終能夠切割染色質關閉狀態的靶位點，用Cas9和gRNA穩定地電轉染人T細胞白血病細胞系Jurkat，這些gRNA靶向9個基因內的表觀遺傳封閉區和2個基因內的開放區作為陽性對照。觀察到Cas9和gRNAs穩定表達的Jurkat細胞的Indel百分比逐漸增加，到第14天達到60 - 100%。這些結果表明，組成型表達的Cas9和gRNA基因敲除受封閉表觀遺傳狀態的阻礙較小。

接下來作者檢測了IL-7預培養是否會影響未刺激T細胞的基因編輯效率（圖4A）。有趣的是，在所有測試基因中，IL-7處理后，Indel百分比逐漸提高（圖4B）。這些結果表明，IL-7預處理可以對未受刺激的T細胞進行遺傳修飾,聯合使用IL-7預處理和雙gRNA靶向進一步提高了未活化T細胞的基因編輯效率（圖4B）。增強基因編輯的機制之一可能與RNP復合物有效進入T細胞有關。事實上，IL-7預培養增加了T細胞對熒光染料TYE 563標記的雙工RNA的攝取，表明轉染效率提高。一般來說，體積小的細胞需要較大的外電場才能實現滲透。Naïve經過IL-7預培養后，T細胞的細胞大小增加，這可能在一定程度上有助于RNP復合物的高效轉染。

圖4.在未激活的T細胞中，IL-7預處理可增強基因編輯效率。(A)電穿孔實驗方案示意圖。將未激活的T細胞在IL-7的存在下培養，指定的時間段用Cas9/gRNA電穿孔，(B)所示數據為每種情況下靶向DPH1、FURIN和SELL的gRNA的估計指數百分比。

總之，該研究證明了在選擇最佳的人T細胞CRISPR/Cas9靶點時需考慮表觀遺傳譜的重要性，結合ATAC-seq數據和可用的預測工具（利用Cas9/gRNA RNP復合物電穿孔人類T細胞的數據，研究這些工具如何精確地預測靶向效率）支持鑒定有效的gRNA靶標。這些發現為人類T細胞的基因編輯提供了大量有效信息。

案例3使用NEPA21電轉染人、小鼠的B細胞

參考文獻：David K, Friedlander G, Pellegrino B, et al. CD74 as a regulator of transcription in normal B cells[J]. Cell Reports, 2022.

轉染物質：siRNA

電轉參數：275V,3ms。

B淋巴細胞通過分泌抗體和細胞因子，并通過其抗原呈遞功能啟動T細胞介導的免疫反應，在體液免疫反應中起關鍵作用。CD74是一種II型跨膜蛋白，主要在抗原呈遞細胞（APC）上表達，CD74 的配體是巨噬細胞遷移抑制因子（MIF）細胞因子超家族，其與CD74 結合以誘導與CD44 形成復合物。該受體復合物對于啟動調節B細胞維持所需的信號級聯反應至關重要并涉及PI3K/AKT通路的激活。該復合物被內化到內吞區室，在那里它被切割釋放CD74 細胞內結構域片段（CD74-ICD）。CD74-ICD易位至細胞核誘導核因子κB（NF-κB）的p65激活結構域磷酸化，并與其共激活因子一起上調TAp63 表達。該激活通路誘導BCL-2表達水平升高，并導致控制 B 細胞增殖和基因的轉錄調控。在之前的研究中，科學家已經證實了CD74在慢性淋巴細胞白血病（CLL）細胞中起著轉錄調節因子的作用，但在B細胞中的功能研究還未有過，因此該研究是很有必要的。

為了研究CD74在B細胞中的功能作者對來源于人和老鼠的正常B細胞進行RNA的提取和逆轉錄、抗CD74抗體活化B細胞、制備ChIP-seq文庫及其序列分析、沉淀抗體加到細胞裂解物中進行免疫沉淀分析、siRNA電轉染B細胞、流式細胞染色、模型構建及數據分析等方法（圖1）。

圖1.CD74在健康與CLL患者的B細胞中轉錄調節作用對比，揭示了在致癌轉化過程中激活或抑制的途徑。

其中在電轉染實驗過程中，作者使用NEPA21電穿孔儀通過電穿孔人和小鼠的B細胞引入siRNA（使用的抑制序列包括：人和老鼠細胞的PAX5；非特異性對照siRNA；圖2H、圖3A）。

圖2H.用PAX5或對照siRNA電轉染純化的健康人B細胞，通過qRT-PCR分析DMTF1的mRNA水平，圖表顯示了所選基因的倍數變化。

圖3.CD74以PAX5 依賴性方式調節 DMTF1轉錄(A:用siRNA PAX5或siCtrl轉染老鼠B細胞，培養后，用載體活化細胞1小時收集細胞并進ChIP，CD74-ICD與DMTF1基因的啟動子區域的結合由qPCR確定.Graph表示輸入富集百分比。

在本研究中，作者研究了CD74-ICD在正常B細胞中的轉錄和調控功能。發現激活后CD74-ICD在胞質溶膠中與轉錄因子（如PAX5）形成復合物，并且與CLL細胞中的結合相比，染色質在位點數量明顯增加。這些結合基因主要部分的表達在惡性細胞中被關閉。CD74-ICD：PAX5復合物結合抑癌基因 DMTF1 的啟動子區域，并通過抑制轉錄下調其表達。這些發現可以幫助確定在致癌轉化過程中受到調節的新治療途徑，并成為未來治療的靶點。

總 結

如今隨著基于細胞的基因治療分子工具被開發利用，包括FDA批準的CAR-T免疫療法、iPSC、細胞重編程和基因編輯等。盡管這些應用取得了很好的結果，但包括核酸和蛋白質在內的等外源分子在細胞內的遞送仍然具有挑戰性，因此，以脈沖電場電穿孔細胞基因轉移具有明顯的處理簡單、高效、高轉染、高存活率以及免疫反應限制低等優勢，電穿孔轉染技術已成為目前最流行的非病毒轉染技術之一。電轉染技術也在由細胞的基因功能紊亂或突變所引發的諸多疾病（如免疫缺陷病、癌癥、帕金森病、阿爾茨海默病等）研究治療中，通過將質粒或相關基因編輯分子工具引入到細胞內來解讀細胞功能、指導細胞命運、重編程細胞行為的重要策略，有望對細胞的正常功能恢復和疾病的治療做出重要貢獻。

NEPA21高效基因轉染系統采用全新設計的電轉程序，配合專利的電壓衰減設計，在獲得高轉染效率的同時，提高細胞存活率。操作簡單，電轉參數可見可調，適用性強。特別適用于難轉染的原代免疫細胞、干細胞、神經細胞、外泌體、類器官、活體動物、受精卵及宮內胚胎等的轉染，已應用于眾多著名期刊文獻中，是進行細胞懸浮/貼壁狀態、活體和離體組織轉染的電轉系統主流品牌之一。

參考文獻

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2. Ito Y, Inoue S, Nakashima T, et al. Epigenetic profiles guide improved CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in human T cells[J]. Nucleic acids research, 2024, 52(1): 141-153.

3. David K, Friedlander G, Pellegrino B, et al. CD74 as a regulator of transcription in normal B cells[J]. Cell Reports, 2022, 41(5).

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6. Heller L C, Heller R. In vivo electroporation for gene therapy[J]. Human gene therapy, 2006, 17(9): 890-897.

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