MST技術在分子層面揭示免疫增效子PcrIIC1的作用
01 研究背景
CRISPR系統是在原核生物中發現的一種適應性免疫系統，可保護宿主細胞免受外來DNA的入侵。作為噬菌體和細菌免疫系統之間持續斗爭的一部分，CRISPR系統已經進化成各種類型，每種類型都具有不同的功能。Cas9蛋白通過向導RNA（sgRNA）切割外源DNA的免疫特性被廣泛研究和應用到基因編輯領域。II型Cas9是這些系統中研究最廣泛的，具有多種亞型。目前尚不確定該家族成員是否能進化出額外的機制來對抗病毒入侵。
本期文獻，研究者們通過前期鑒定大量基因及蛋白預測工作，揭示了II-C型Cas9的三個結構生長軌跡，進而發現了Chrysobacterium物種的CbCas9會與CRISPR–Cas系統促進（pro-CRISPR）蛋白（PcrIIC1）形成異源四聚體復合物。驗證PcrIIC1能夠作為一種CRISPR免疫增效子。作者借助MST技術直接在分子層面直觀揭示了PcrIIC1免疫增效子的增強效果，降低實驗設計難度，節省大量成本和時間。
02 研究內容
2024年5月29日，清華大學生命學院劉俊杰 (Jun-Jie Gogo Liu) 課題組聯合北京大學生命學院白洋課題組和清華大學生命學院陳春來課題組在 Nature 雜志在線發表了題為“Pro-CRISPR PcrIIC1-associated Cas9 system for enhanced bacterial immunity” 的研究論文。
研究者鑒定了2062個完整的Cas9基因座，預測出相關蛋白結構，并揭示了II-C型Cas9的三個結構生長軌跡。研究者發現新的相關基因（NAG）往往存在于較大的II-C Cas9的基因座中。通過生化實驗和冷凍電鏡解析復合體結構表明，來自金黃色細菌屬（Chryseobacterium sp.）的CbCas9生長出了一個全新的增強Cas9活性的β-REC2結構域，以及一個全新的能夠與其關聯基因PcrIIC1互作的CTH結構域。通過蛋白間相互作用，2個CbCas9蛋白和2個PcrIIC1蛋白能夠形成異源四聚體復合物。這意味著PcrIIC1可以在整個CRISPR防御過程中與CbCas9結合。
為什么PcrIIC1要和Cas9結合呢？研究者通過MST實驗直觀地揭曉了答案。
MST實驗顯示PcrIIC1和apo-CbCas9之間具有中等的結合親和力（Kd=2.56±0.28μM）（圖1a）。值得注意的是，PcrIIC1和CbCas9–sgRNA之間的結合親和力增加到334±120 nM的Kd值，PcrIIC1和Cb Cas9–sgRNA–dsDNA之間的結合親和性增加到275±86 nM（28 bp）（圖1b，c），表明sgRNA表達可能作為天然宿主中異源四聚體組裝的檢查點。（CRISPR免疫防御系統是通過Cas9蛋白與sgRNA結合來切割外源DNA來實現的，這個特性也被廣泛研究和應用到基因編輯領域。）
圖1. MST和冷凍電鏡分析CbCas9和PcrIIC1結合的三個階段
CbCas9與PcrIIC1結合后復合物有什么作用，為什么說PcrIIC1是免疫增效子呢？
MST實驗也給出了直觀的答案。與單獨的CbCas9相比，CbCas9-PcrIC1復合物表現出增強的DNA結合（圖2a）進而體現出切割活性，對原間隔區相鄰基序序列的兼容性更廣，對錯配的耐受性更強，抗噬菌體免疫性增強。
圖2. PcrIIC1增強CbCas9的DNA結合(a)、切割(b)、PAM兼容性(c)、DNA解旋 (d) 和錯配容忍 (e) 能力
*圖片來源https://life.tsinghua.edu.cn/info/1131/5848.htm
最后，為了檢驗CRISPR免疫增效子PcrIIC1對CbCas9抗噬菌體免疫能力的影響，研究人員在大腸桿菌中進行了抗噬菌體實驗。實驗結果表明PcrIIC1顯著提升CbCas9系統對噬菌體的抵抗，且如果破壞CbCas9與PcrIIC1的相互作用，會導致增強的免疫力喪失。以上結果說明CbCas9-PcrIIC1復合體的形成對整個CRISPR-Cas系統的免疫增強至關重要。
03 技術優勢
本研究利用MST技術在分子層面直觀的揭示了免疫增效子PcrIIC1的作用。對于分子互作親和力的檢測，Monolith系列儀器不依賴于分子量變化，蛋白用量少，是一種在溶液狀態下表征分子互作的技術。對于蛋白可能需要形成多聚體，在溶液環境下，更能有效的體現蛋白與蛋白互作的真實情況。
當蛋白質形成復合物后，進一步的功能探究，如蛋白復合物與核酸的相互作用，通過Monolith系列儀器進行的實驗設計更為簡便，能夠直觀地展示相互作用的結果，從而凸顯您研究的分子功能。
CRISPR系統是在原核生物中發現的一種適應性免疫系統，可保護宿主細胞免受外來DNA的入侵。作為噬菌體和細菌免疫系統之間持續斗爭的一部分，CRISPR系統已經進化成各種類型，每種類型都具有不同的功能。Cas9蛋白通過向導RNA（sgRNA）切割外源DNA的免疫特性被廣泛研究和應用到基因編輯領域。II型Cas9是這些系統中研究最廣泛的，具有多種亞型。目前尚不確定該家族成員是否能進化出額外的機制來對抗病毒入侵。
本期文獻，研究者們通過前期鑒定大量基因及蛋白預測工作，揭示了II-C型Cas9的三個結構生長軌跡，進而發現了Chrysobacterium物種的CbCas9會與CRISPR–Cas系統促進（pro-CRISPR）蛋白（PcrIIC1）形成異源四聚體復合物。驗證PcrIIC1能夠作為一種CRISPR免疫增效子。作者借助MST技術直接在分子層面直觀揭示了PcrIIC1免疫增效子的增強效果，降低實驗設計難度，節省大量成本和時間。
02 研究內容
2024年5月29日，清華大學生命學院劉俊杰 (Jun-Jie Gogo Liu) 課題組聯合北京大學生命學院白洋課題組和清華大學生命學院陳春來課題組在 Nature 雜志在線發表了題為“Pro-CRISPR PcrIIC1-associated Cas9 system for enhanced bacterial immunity” 的研究論文。
研究者鑒定了2062個完整的Cas9基因座，預測出相關蛋白結構，并揭示了II-C型Cas9的三個結構生長軌跡。研究者發現新的相關基因（NAG）往往存在于較大的II-C Cas9的基因座中。通過生化實驗和冷凍電鏡解析復合體結構表明，來自金黃色細菌屬（Chryseobacterium sp.）的CbCas9生長出了一個全新的增強Cas9活性的β-REC2結構域，以及一個全新的能夠與其關聯基因PcrIIC1互作的CTH結構域。通過蛋白間相互作用，2個CbCas9蛋白和2個PcrIIC1蛋白能夠形成異源四聚體復合物。這意味著PcrIIC1可以在整個CRISPR防御過程中與CbCas9結合。
為什么PcrIIC1要和Cas9結合呢？研究者通過MST實驗直觀地揭曉了答案。
MST實驗顯示PcrIIC1和apo-CbCas9之間具有中等的結合親和力（Kd=2.56±0.28μM）（圖1a）。值得注意的是，PcrIIC1和CbCas9–sgRNA之間的結合親和力增加到334±120 nM的Kd值，PcrIIC1和Cb Cas9–sgRNA–dsDNA之間的結合親和性增加到275±86 nM（28 bp）（圖1b，c），表明sgRNA表達可能作為天然宿主中異源四聚體組裝的檢查點。（CRISPR免疫防御系統是通過Cas9蛋白與sgRNA結合來切割外源DNA來實現的，這個特性也被廣泛研究和應用到基因編輯領域。）
圖1. MST和冷凍電鏡分析CbCas9和PcrIIC1結合的三個階段
CbCas9與PcrIIC1結合后復合物有什么作用，為什么說PcrIIC1是免疫增效子呢？
MST實驗也給出了直觀的答案。與單獨的CbCas9相比，CbCas9-PcrIC1復合物表現出增強的DNA結合（圖2a）進而體現出切割活性，對原間隔區相鄰基序序列的兼容性更廣，對錯配的耐受性更強，抗噬菌體免疫性增強。
圖2. PcrIIC1增強CbCas9的DNA結合(a)、切割(b)、PAM兼容性(c)、DNA解旋 (d) 和錯配容忍 (e) 能力
*圖片來源https://life.tsinghua.edu.cn/info/1131/5848.htm
最后，為了檢驗CRISPR免疫增效子PcrIIC1對CbCas9抗噬菌體免疫能力的影響，研究人員在大腸桿菌中進行了抗噬菌體實驗。實驗結果表明PcrIIC1顯著提升CbCas9系統對噬菌體的抵抗，且如果破壞CbCas9與PcrIIC1的相互作用，會導致增強的免疫力喪失。以上結果說明CbCas9-PcrIIC1復合體的形成對整個CRISPR-Cas系統的免疫增強至關重要。
03 技術優勢
本研究利用MST技術在分子層面直觀的揭示了免疫增效子PcrIIC1的作用。對于分子互作親和力的檢測，Monolith系列儀器不依賴于分子量變化，蛋白用量少，是一種在溶液狀態下表征分子互作的技術。對于蛋白可能需要形成多聚體，在溶液環境下，更能有效的體現蛋白與蛋白互作的真實情況。
當蛋白質形成復合物后，進一步的功能探究，如蛋白復合物與核酸的相互作用，通過Monolith系列儀器進行的實驗設計更為簡便，能夠直觀地展示相互作用的結果，從而凸顯您研究的分子功能。
Monolith分子互作檢測儀
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