免疫組織化學 (Immunohistochemistry，IHC)，一種用于檢測組織切片中特定抗原或蛋白質的方法。以已知的抗體為探針，與組織或細胞中的特定抗原 (如多肽、蛋白質等) 進行特異性的結合。隨后，利用化學反應將這些抗原-抗體復合物進行可視化，從而實現對未知抗原在組織或細胞中的定性、定位甚至定量研究。

 
IHC 檢測可分為直接法 (又稱一步法) 和間接法 (二步、三步或多步法)。直接檢測方法是直接與偶聯物 (例如熒光染料、酶、膠體金或生物素) 結合標記的一抗的一步過程。直接法快速，但對于檢測常規處理的組織中的大多數抗原缺乏足夠的靈敏度 (圖 2)。

為了滿足靈敏度更高的抗原檢測的需求，Coons 等人開發了一種兩步法。第一層抗體未標記，而第二層抗體 (針對一抗而產生) 則被標記 (圖 2)。
 

間接法的靈敏度高于直接法： 

未標記的一抗保留了完全的親和力，具有更強的抗原結合力，并且每分子一抗的標記物（例如過氧化物酶）數量更多，從而增加了反應強度。

• 間接法可以用較少的一抗檢測較少量的抗原，用于放大一抗信號，因為一個一抗至少可以結合兩個帶標記的二抗。
• 間接法也比直接法更方便，因為相同的二抗可用于檢測不同的一抗，前提是后者是在同一物種中產生的。

IHC 實驗流程：通常包括樣本固定、包埋、切片、脫蠟水化、抗原修復、滅活、封閉、一抗孵育、二抗孵育、顯色、復染、封片觀察 12 個部分。

1

樣本固定

目的

1) 充分保存細胞成分，包括可溶性和結構性蛋白質；

2) 防止細胞成分 (包括抗原和酶) 自溶和置換；
3) 穩定細胞材料，避免后續程序產生有害影響；
4) 便于常規染色和免疫染色[1]。

甲醛是常規組織學和免疫組織化學固定劑的金標準。甲醛主要保存肽和細胞器的一般結構。

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基本步驟：

1）取材：從動物或人體取得所需的組織樣本。對于組織塊，要確保其大小適中，不宜過大，以便于固定液能夠充分滲透。

2）初步處理：如果組織樣本帶有血液或其他體液，應先用生理鹽水或 PBS 進行沖洗，以去除這些可能影響固定效果的物質。

3）固定：將組織樣本放入固定液中。常用的固定液包括 10% 中性緩沖福爾馬林 (Formalin，也稱為甲醛)、甲醇、乙醇或它們的混合液等。固定液的量通常為組織體積的 10-20 倍，以確保組織能夠充分浸入固定液中。大組織標本應切開固定，以免中間部分自溶解腐敗。

☑ 固定時間根據組織類型和實驗要求而定，一般固定時間室溫 18-24 h。
4）固定后的處理：固定完成后，將組織從固定液中取出，用流水沖洗數分鐘，以去除殘留的固定液和可能產生的結晶。
 

   注意事項：

• 固定的時間不宜過長，以免導致組織過度硬化和抗原性的喪失。

• 固定的溫度通常為室溫或 4°C，避免高溫導致組織損傷。

• 在固定過程中，要確保組織樣本完全浸入固定液中，避免出現未固定的部分。

• 固定的容器應干凈、無雜質，避免對組織造成污染。

2

包埋

目的

保護和支撐組織樣本，以便在切片時保持其完整性。通過將組織樣本嵌入到固體介質中，可以制作出適合在顯微鏡下觀察的薄切片。

常用的包埋介質包括石蠟、樹脂等。石蠟包埋是免疫組化中最常用的方法，因為它可以有效保存組織形態，提升切片質量。樹脂包埋則常用于需要更高分辨率或特殊染色方法的樣本。

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基本步驟：

1）脫水：在組織樣本固定后，需要將其中的水分去除，以便于包埋介質能夠充分滲透。酒精梯度脫水: 75% 乙醇、85% 乙醇、95% 乙醇、無水乙醇 (I)、無水乙醇 (II) 分別浸泡 1 min。

2）透明：脫水后，組織樣本會變得不透明，需要使用透明劑（如二甲苯）來去除其中的酒精和其他溶劑，使組織樣本變得透明。通常用二甲苯浸泡兩次，每次浸泡 1min。
3）浸蠟：將透明后的組織樣本放入熔化的石蠟中，讓石蠟充分滲透到組織樣本中。這個過程通常需要在溫箱中進行，以確保石蠟的均勻滲透。
4）包埋：將浸蠟后的組織樣本放入模具中，倒入熔化的石蠟，然后讓石蠟冷卻凝固。這樣，組織樣本就被包埋在石蠟中了。

   注意事項：

• 在包埋過程中，要控制好溫度和時間，以確保石蠟的均勻滲透和組織的完整性。

• 包埋后的組織塊需要冷卻凝固后才能進行切片。在冷卻過程中，要避免過度冷卻導致石蠟碎裂或組織變形。

• 在包埋前，要對組織樣本進行充分的固定和脫水處理，以確保其抗原性和完整性。

3

切片

目的

將包埋后的組織樣本切割成薄片，以便于在顯微鏡下觀察和檢測。

基本步驟：

1）切片前的準備：確保包埋后的組織塊已經充分冷卻并固化。使用適當的切片機進行切片。

2）切片：將包埋好的組織塊固定在切片機的樣本夾上。調整切片機的切片厚度，通常為 4-5 微米厚，這個厚度是根據需要檢測的抗原和實驗要求來確定的。

3）展片：使用刷子或毛筆輕輕地將切好的組織切片從刀上取下，并放在溫水 (40℃) 中展開。

4）烤片：60℃ 烤片 2 h。

   注意事項：

• 在切片過程中，要控制好切片機的速度和切片刀的鋒利度，以獲得高質量的切片。

• 切片后，要及時對切片進行處理，以避免抗原的損失和組織的變性。

• 使用適當的黏貼劑，確保切片牢固地附貼在載玻片上，以便于后續的免疫組化實驗。

4

脫蠟水化

目的

將組織切片從石蠟中釋放出來，并使其恢復到適合進行后續抗原檢測和染色的狀態。

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基本步驟：

1）脫蠟：切片首先被置于二甲苯中浸泡，以溶解和去除切片上的石蠟。通常，這個過程會分為多個步驟，每步大約持續 5 分鐘，以確保石蠟被完全去除。例如，可以使用二甲苯 Ⅰ、二甲苯 Ⅱ 和二甲苯 Ⅲ 分別浸泡 5 min。

2）水化：依次置于無水乙醇 I、無水乙醇 II，95% 乙醇、85% 乙醇和 70% 乙醇中，各浸泡 1 次，5 min/ 次；再放入純化水中清洗浸泡 5 min。

   注意事項：

• 徹底脫蠟：脫蠟過程必須徹底，以確保石蠟被完全去除。否則，殘留的石蠟會影響后續的抗原檢測和染色。

• 避免干燥：在整個脫蠟水化過程中，應確保切片始終保持在濕潤的狀態，避免干燥。干燥會導致非特異性抗體結合，從而出現高背景染色。

5

抗原修復

目的

重新暴露或修正這些被封閉或扭曲的抗原，以提高免疫組化實驗中的抗體與抗原的結合率，增強信號的強度和特異性[3]。

最常用的修復緩沖液是 10 mM 的 pH 6.0 枸櫞酸鈉、pH 9.0 的 Tris-EDTA 、pH 8.0 的 EDTA。建議測試多種方法以尋找染色效果最佳的方法。

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抗原修復的方法：

(1) 微波熱修復：加入抗原修復液，放入切片，置于微波爐中火 8 min，停火 7 min，轉小火 8 min；取出染色盒，冷卻至室溫。

(2) 水浴熱修復: 加入抗原修復液，放入切片，置于水溶鍋中加熱，其間不斷用溫度計測其溫度，待抗原修復液的溫度達到有效度 (92℃)，維持 40 min 后取出染色盒，冷卻至室溫。
(3) 高壓熱修復: 在染色盒中加入抗原修復液，放入切片，置于高壓鍋內加熱至飽壓后繼續加熱 5 min，關閉電源，10 min 后取出染色盒，冷卻至室溫。

(4) 酶解修復：常用的消化酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶 K 等。將切片置于含有酶解液的載玻片上，然后在適當的溫度和濕度條件下進行酶解 (通常為 37°C，20 min)。酶解后，同樣需要冷卻切片至室溫再進行后續處理。

   注意事項：

• 加熱后需自然降溫；

• 使用過量的抗原修復液；

• 修復液的不同 pH 值對染色結果的影響比較大；

• 沒有一種抗原修復緩沖液可以適用于所有抗原。不同的抗體可能需要不同的抗原修復方法和條件，因此需要根據實驗要求和抗體特性選擇合適的抗原修復方法。

6

滅活

目的

消除細胞或組織中內源性酶和活性物質的影響，降低背景噪音，提高實驗的特異性和敏感性[4]。

(1) 滅活內源性過氧化物酶：HRP 檢測系統，常用的去除內源性過氧化物酶的方法是 3% 過氧化氫水溶液，室溫 10 min。

(2) 洗滌：用 PBS 或 TBS 等緩沖液洗滌切片、浸泡 2 次，5 min/ 次。

   注意事項：

• H₂O₂ 需現用現配，且 4℃ 避光保存，否則易引起非特異背景。

• H₂O₂ 孵育時間過長也會易引起脫片。

• 部分組織還含有內源性堿性磷酸酶，可用左旋咪唑進行滅活。

   

7

封閉

目的

封閉組織切片上非特異性結合位點，防止抗體與這些位點結合，從而減少背景信號。

基本步驟：

1）非特異位點封閉：將封閉液 (如 5% BSA 或血清等) 滴加到組織切片上，確保封閉液均勻覆蓋整個組織區域。然后將切片放入濕盒中，在室溫或 37°C 下孵育 30 min，讓封閉液與組織切片充分作用。

2）洗滌：封閉結束后，用 PBS 或 TBS 等緩沖液洗滌切片，以去除未結合的封閉液和可能存在的雜質。

8

一抗孵育

免疫組化中的一抗孵育是免疫組化實驗的關鍵步驟之一。

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基本步驟：

1）選擇一抗：根據實驗目的選擇特異性高、親和力強的一抗。一抗應該與目標抗原的種屬來源、類型等相匹配。

2）稀釋一抗：根據一抗的效價和實驗要求，用適當的稀釋液 (如 PBS、TBS 等) 稀釋一抗。
3）涂覆一抗：將稀釋好的一抗均勻涂覆在已封閉的組織切片上，確保抗體能夠充分接觸組織切片上的抗原。
4）孵育：將稀釋好的一抗均勻滴加在已封閉的組織切片上，放入濕盒中，室溫 (或 37°C) 孵育 1 h，使一抗與抗原充分結合。

   注意事項：

• 確保一抗的質量和特異性，避免使用過期或質量不佳的一抗。

• 充分洗滌組織切片，去除未結合的一抗和其他雜質，減少背景染色。

9

二抗孵育

二抗的作用是與一抗結合，形成抗原-抗體-抗體復合物，從而增強信號的強度和特異性。

在免疫組化實驗中，二抗通常帶有標記酶 (如 HRP.AP 等)，這些標記物在后續的顯色步驟中可以產生可見的染色信號，便于在顯微鏡下觀察目標抗原在組織中的分布和表達情況。

二抗孵育的基本步驟：

1) 稀釋二抗：參考二抗的說明書，按照適當比例用封閉液或其他適當的溶液稀釋二抗。 

2) 孵育二抗：將稀釋好的二抗滴加在已經過一抗孵育并洗滌的組織切片上，室溫孵育 30 min-60 min。

3) 洗滌：孵育完成后，使用洗滌液 (如 PBST 或 TBST) 在搖床上緩慢搖動洗滌切片，以去除未結合的二抗和其他雜質。洗滌通常需要重復幾次，每次洗滌時間一般為 5-10 分鐘。‍‍‍‍‍‍

注意事項：

二抗的選擇和稀釋比例應根據實驗的具體要求和一抗的特性來確定。

對于抗體的選擇還有疑惑的小伙伴可以翻翻小 M 的往期推文：官宣! MCE 迎來了一位新成員——抗體

10

顯色

顯色檢測中需要考慮的其他因素有酶和顯色底物的選擇。每種檢測酶都有幾種不同的顯色劑。HRP-DAB 是最常用的顯色劑組合。

原理：在免疫組化中通常使用辣根過氧化物酶 (HRP) 或堿性磷酸酶 (AP) 等作為標記酶。這些酶能催化底物發生顏色反應，從而在抗原所在的位置形成可見的沉淀物。

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基本步驟：

1）加入酶的底物 (如 HRP 的底物為 DAB，AP 的底物為 BCIP/NBT)。

2）底物在酶的作用下發生化學反應，形成有色沉淀物，通常呈現棕色 (對于HRP-DAB 系統) 或藍色 (對于 AP-BCIP/NBT 系統)。

3）通過顯微鏡觀察組織切片上的顏色變化，可以確定抗原在細胞或組織中的位置和表達水平。

   注意事項：

• 選擇適當的檢測系統：根據實驗目的和樣本特性選擇合適的檢測系統；

• 優化條件：對一抗、二抗的濃度、孵育時間和溫度等條件進行優化，以獲得最佳的檢測結果。

• 注意防護：DAB 為聯苯偶氨化合物，可誘發皮膚癌和膀胱癥，在顯色操作過程中需注意防護。

11

復染

為了形成細胞輪廓，更好的定位目標蛋白，可進行復染[5]。

復染：滴加 80-100 μL 蘇木素染色液至完全覆蓋組織，室溫孵育 5 min，自來水沖洗返藍。

   注意事項：

• 復染的時間是需要摸索的，這個與蘇木精的配制時間有關。

• 如果染色過淺可重復染色，如果染色過深可使用鹽酸進行分化。

12

封片觀察

在免疫組化實驗中，封片觀察是最后的步驟，用于保護組織切片、增強對比度和穩定性，并允許在顯微鏡下進行長期觀察和分析。

封片步驟：
1）脫水：在完成所有染色步驟后，通常需要將組織切片進行脫水處理，以去除切片上的水分。切片依次使用 70%、85%、95% 乙醇、無水乙醇 I、無水乙醇 Ⅱ 分別浸泡 1 min。

2）透明：脫水后，切片需要進行透明處理，以便封片劑能夠均勻分布在切片上。通常使用二甲苯浸泡兩次，每次 1 min。

3）封片：將一滴封片劑 (如中性樹膠、甘油明膠等) 滴在組織切片上，然后用蓋玻片輕輕覆蓋。封片劑的選擇取決于實驗要求和標本類型。封片時要確保沒有氣泡產生，并且蓋玻片與切片之間緊密貼合。

4）干燥：讓封片劑自然干燥，或者可以在溫箱中加速干燥過程。干燥后的切片可以長期保存，并隨時用于觀察。

   注意事項：

• 封好的切片可以長期保存，但應放置在干燥、避光、溫度適宜的環境中，以避免切片受潮、褪色或損壞。
• 封片劑和某些化學試劑可能對人體有害，因此在進行封片操作時要注意安全防護措施，如佩戴手套、眼鏡等。

   

▐ Q1：染色弱？
實驗過程中，我們常會遇到染色較弱的情況，如下圖所示：

   可能性原因：
1）抗體濃度過低，孵育時間過短，可提高抗體濃度，延長孵育時間；
2）檢查試劑是否超過有效期；
3）檢查標本固定方式、抗原修復方式是否適合目標抗原；
4）未瀝干切片水份，致使試劑稀釋。建議滴加試劑前瀝干切片中多余的緩沖液(注意防止切片干燥)；
5）孵育溫度過低，若室溫低于 15℃，要改放在 37℃ 孵育箱孵育 30-60 min (或 4℃ 冰箱過夜)。

▐ Q2：產生非特異性染色？

在使用檢測進行診斷之前，必須了解反應在細胞或組織內的預期抗原分布。如下圖所示，CD79a 抗體僅染色了漿細胞瘤細胞的細胞核。根據目前對該抗原位置(細胞質和細胞質膜) 的了解，該反應被認為不是特異性的。

注：非特異的原因也有是因為修復方式不對，可能是修復太強了。

下部插圖是異常染色的細節；上部插圖描繪了漿細胞瘤中 CD79a 的典型細胞質染色。條 = 60 μm，兩個插圖條 = 5 μm。

   可能性原因：
1）抗體孵育時間過長、抗體濃度高易增加背景著色。這可通過縮短一抗/二抗孵育時間、稀釋抗體來控制；

2）一抗用多克隆抗體易出現非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看；

3）內源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高 (含血細胞多的組織)，需要通過延長滅活時間和增加滅活劑濃度來降低背景染色；

4）非特異性組分與抗體結合，需延長封閉時間和適當增加濃度來加強封閉效果；

5）DAB 孵育時間過長或濃度過高；

6）洗滌不充分，可增加洗滌次數和洗滌時間；

7）染色過程中出現干片。干片容易導致非特異性染色，實驗過程中需避免干片。

▐ Q3：免疫組化染色呈陰性結果的原因？

   可能性原因：
1）抗體濃度和質量問題以及抗體來源選擇錯誤，重新確認抗體信息；

2）確認試劑是否遺漏，添加順序是否正確；

3）抗原修復條件不合適，摸索最合適抗原修復條件；

4）組織切片本身這種抗原含量低，建議用已知陽性樣本作陽性對照。

▐ Q4：背景強？

 

   可能性原因：
1）檢查一抗和二抗濃度過高，需摸索合適的抗體濃度；

2）是否有效去除內源性酶和生物素，可延長內源性酶滅活時間；

3）血清封閉時間是否過短，可延長封閉時間；

4）檢查一抗的特異性是否良好，選擇特異性高的抗體；

5）適當增加抗體孵育后的洗滌次數和延長洗滌時間。

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IRF3 Antibody IRF3 Antibody 是一個非偶聯、兔源、抗 IRF3 單克隆抗體。它可用于人、小鼠背景下 WB、ICC/IF、IHC-P、FC 實驗。

Ki-67 Antibody 該抗體是一個非偶聯、兔來源、抗 Ki-67 多克隆抗體。同時是直腸癌、宮頸癌等免疫組化檢查指標之一。可用于人、小鼠、背景下的 WB, ELISA, IHC-P, IHC-F, Flow-Cyt, ICC, IF 實驗。

p16 Antibody 該抗體是一個非偶聯、兔來源、抗 p16 單克隆抗體。它是宮頸癌等免疫組化檢查指標之一，可用于人背景下 WB, IHC-P 實驗。

p53 Antibody 該抗體是一個非偶聯、兔源、抗 p53 單克隆抗體。它可用于人背景下 WB、ICC/IF、IHC-P、IP 實驗。

HRP-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG H&L 該抗體是偶聯了 HRP 標記、山羊來源的抗小鼠 IgG 抗體。它可結合小鼠 IgG 抗體的輕鏈和重鏈，用于小鼠背景下 WB、ELISA、IHC 實驗。

HRP-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG H&L    該抗體是偶聯了 HRP 標記、山羊來源的抗兔 IgG 抗體。它可結合兔 IgG 抗體的輕鏈和重鏈，用于兔子背景下 WB、IHC-P、ELISA 實驗。

參考文獻：
[1] Ramos-Vara JA,et al. When Tissue Antigens and Antibodies Get Along: Revisiting the Technical Aspects of Immunohistochemistry—The Red, Brown, and Blue Technique. Veterinary Pathology. 2014;51(1):42-87. 

[2] Amereh M,et al.Immunohistochemistry (IHC) staining of in-vitro cancer cell-generated tumoroids. MethodsX. 2023 Jun 3;10:102242. 
[3] Shi SR,et al.Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. J Histochem Cytochem. 1991 Jun;39(6):741-8.
[4] Hussaini HM,et al.Immunohistochemistry and Immunofluorescence. Methods Mol Biol. 2023;2588:439-450.
[5] Mebratie DY,et al.Review of immunohistochemistry techniques: Applications, current status, and future perspectives. Semin Diagn Pathol. 2024 May;41(3):154-160.
[6] Ramos-Vara JA, et al. Suggested Guidelines for Immunohistochemical Techniques in Veterinary Diagnostic Laboratories. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 2008;20(4):393-413.