Mechanoresponsive ETS1 causes endothelial dysfunction and arterialization in varicose veins via NOTCH4/DLL4 signaling

Keywords: ETS; Endothelium; Notch; Shear stress; Therapeutics; Varicose veins.

慢性靜脈疾病，通常稱為靜脈曲張，其特征是靜脈血回流不足，嚴重的臨床表現包括出血和皮膚潰爛經久不愈。最近的研究報告稱，靜脈曲張與靜脈血栓栓塞和外周動脈疾病的高風險有關。

當靜脈暴露于流量較高或血流變化的循環時，會發生組織學變化，例如內膜增生、管壁增厚、靜脈內皮標志物丟失和動脈內皮標志物表達。這個過程稱為異常靜脈動脈化。研究表明，隱靜脈的動脈化有助于靜脈曲張的發病機制。此外，發現與Notch信號通路相關的動脈內皮標志物，如DLL4、HEY2和ephrin B2，在靜脈曲張中增加。靜脈曲張中功能失調的單向瓣膜和靜脈壁擴張會導致血流動力學改變，盡管在發病機制的初級階段是很微妙的。同時，血壓和剪切應力等生物力學力是Notch信號傳導的公認決定因素，然而，力檢測的機制及其與Notch激活的耦合是未知的。

靜脈血流力學調節Notch信號傳導的機制知之甚少。最近，機械敏感的 E26 轉化特異性序列-1（ETS1）被證明與 Notch 復合物結合并誘導內皮 NOTCH1 和 NOTCH4 受體以及 DLL4 配體。ETS1表達及其DNA結合活性與高動脈剪切應力相關。

最近，印度拉吉夫-甘地生物技術中心及Sri Jayadeva 心血管科學研究所的課題團隊研究了ETS1在人靜脈曲張中的表達模式，發現了 ETS1 如何在擾動流體剪切應力下調節靜脈 ECs中 Notch 受體及其相應配體的表達譜。此外，還檢查了與對照隱靜脈相比，靜脈曲張中活化Notch受體和其配體的表達是否增強以及靜脈血流紊亂是否在與靜脈動脈化相關的分子變化中起作用。研究成果發表在 European Journal of Cell Biology 期刊題為“Mechanoresponsive ETS1 causes endothelial dysfunction and arterialization in varicose veins via NOTCH4/DLL4 signaling”。

首先，為了在靜脈曲張發病機制的背景下檢查Notch信號，使用qRT-PCR分析了靜脈曲張和對照隱靜脈中Notch受體和配體的相對基因表達。結果表明，與健康靜脈相比，靜脈曲張中的NOTCH1（1.41倍）、NOTCH3（1.47倍）和NOTCH4（2.42倍）顯著上調，編碼Notch配體（如DLL3、DLL4和JAG1）的基因也上調。組織學分析表明，與正常靜脈相比，靜脈曲張的內層增厚，具有明顯的內膜形成，表明靜脈壁動脈化。免疫染色分析顯示，活化的裂解Notch受體（NICD1、NICD3、NICD4）和DLL4和JAG1在靜脈曲張中的表達顯著升高。通過蛋白質印跡和密度測定法進一步定量了對照靜脈和靜脈曲張中NICD4 和 DLL4 的表達，發現它們在靜脈曲張中的上調具有統計學意義。

然后，評估了 ETS1 在靜脈曲張和對照靜脈中的表達。結果表明，靜脈曲張中ETS1 mRNA轉錄本上調（1.86倍），表明ETS1在疾病進展中起關鍵作用（圖1 A）。ETS1 通過其蘇氨酸-38 殘基的磷酸化而被激活。使用 ETS1 pThr38 和 ETS1 總抗體的蛋白質印跡分析顯示，磷酸化的 ETS1（pETS1）在靜脈曲張組織勻漿中的表達顯著高于正常靜脈（圖1 B、C）。

免疫組化定位顯示，細胞核pETS1在人靜脈曲張的所有組織層中均有顯著表達（圖1 D、E），但對照靜脈中沒有ETS1的核表達。通過驗證pETS1的亞細胞定位，發現ETS1確實定位于細胞核，并在靜脈曲張的新內膜區域密集染色，而在對照靜脈中未顯著顯示其表達（圖1 D、F、G）。此外，在對照靜脈和靜脈曲張中共定位 EC 標志物 CD31 與 pETS1，發現與對照靜脈相比，CD31 在靜脈曲張中顯著下調，然而，在靜脈曲張中，細胞質 CD31 與核 pETS1 共表達。

圖1 靜脈曲張中 ETS1 的上調。

接下來，將血管內皮細胞珠EA.hy926 暴露于剪切應力（6 dyne/cm2）以探索機械敏感 Notch 蛋白和 ETS1 在各種流體流動條件下的潛在表達。細胞經受不同的剪切應力狀態（靜態、PF 和 DF），以模擬正常和受影響靜脈中管腔內皮對血流模式的反應。qRT-PCR分析不同剪切應力條件下細胞中NOTCH1-4、Notch配體（DLL3、DLL4、JAG1、JAG2）和ETS1的基因表達（圖2 A），發現擾動剪切應力（DF）在靜脈 ECs 中誘導 NOTCH4、DLL4、JAG1和 ETS1的顯著表達（圖2 A）。

蛋白質印跡分析證實，與均勻平行流動（PF）和靜態條件相比，DF細胞中活化的NOTCH4（NICD4）和DLL4表達穩定增加（圖2 B）。與平行流動的細胞相比，暴露于DF的細胞中活化的pETS1的表達顯著升高（圖2 C）。為了評估 EA.hy926 細胞的完整性，檢測了EC 標志物 CD31 和 eNOS，發現與PF和靜態細胞相比，DF細胞中CD31和活化的peNOS蛋白逐漸減少（圖2 B、C）。

對暴露于流動條件的 ECs 進行 NICD1、NICD4、pETS1 和 DLL4 的免疫熒光分析，發現NICD1 在靜態、PF 或 DF 的細胞中均無差異（圖2 D、E）。這些結果證實了暴露于各種流動條件的細胞中的NOTCH1 mRNA的水平。NICD1雖然是一種內皮型，但在靜態、PF或DF的細胞中沒有差異（圖2 D、E），然而，暴露于 DF 的 NICD4 和 pETS1 的表達顯著增加，并有明顯的核定位（圖2 D、E、F）。Notch 配體 DLL4 表現出廣泛的細胞質表達模式。盡管 ETS1 mRNA 在暴露于 DF 的細胞中高表達，但 ETS1 總蛋白的差異表達在不同流動條件的細胞中并不顯著（圖2 B）。

圖2 ETS1-Notch4/DLL4 在擾動流體剪切應力下靜脈內皮細胞（EC）中的信號轉導。

最后，為了進一步了解 ETS1 蘇氨酸38 在靜脈血流改變下的磷酸化機制，研究人員探索了某些抑制劑，如 U0126（MEK1/2 抑制劑）、BIX02189（MEK5 抑制劑）和 SB203580（P38 MAPK 抑制劑）對暴露于 DF 的 ECs 的影響。結果表明，U0126 顯著降低 pETS1 核表達，突出了 MEK1/2 信號在 ETS1 激活中的重要性。在隨后的擾動剪切應力刺激下，U0126 處理的細胞中 pETS1 降低。MEK5 抑制劑也導致 pETS1 減少，表明 MEK1/2 和 MEK5 在響應 DF 的 ETS1 磷酸化中存在潛在的相互作用。然而，P38 MAPK通路似乎在DF下的pETS1表達中沒有作用。這表明，擾動流主要通過 MEK1/2 級聯誘導 ETS1。

然后，敲低 EA.hy926 細胞中 ETS1 的表達，將有或沒有 ETS1 敲低（ETS1KD）的 ECs 暴露于剪切應力。當 ETS1KD ECs 受到擾動剪切應力時，ETS1 mRNA 水平持續降低（圖3 B）。此外，在擾動流條件下，ETS1 的缺失顯著降低了 NICD4 和 DLL4 蛋白水平（圖3 A）。

使用 TK216（ETS抑制劑）化學抑制 ETS1 結合活性，發現NICD4和DLL4水平降低，與ETS1KD細胞所觀察的一致（圖3 C）。此外，與擾動剪切應力下的對照siRNA轉染細胞相比，ETS1KD細胞中的NICD4和DLL4蛋白分別降低了5.75倍和4.49倍；與未處理和DF 處理24小時的細胞相比，TK216處理的ECs分別降低了5.27倍和6.44倍（圖3 D）。值得注意的是，即使在 DF 下，用 TK216 處理也會導致內皮基因的表達升高，特別是 eNOS、VE-鈣粘蛋白和 vWF（圖3 E）。這些數據表明，暴露于靜脈血流紊亂的細胞中 ETS1 的分子和化學抑制消除了 Notch 信號。

圖3 pETS1 促進靜脈內皮細胞（EC）中剪切應力誘導的 Notch 活化。

圖4 圖形概要

總之，該研究目前的研究結果為擾動靜脈剪切應力在靜脈曲張中誘導異常 NOTCH4/DLL4 信號傳導中的作用提供了寶貴的見解。機械敏感轉錄因子 ETS1 已被確定為 NOTCH4/DLL4 誘導的靜脈曲張信號的激活劑，可能是調節靜脈曲張動脈化的有希望的靶標。

參考文獻：Sreelakshmi BJ, Karthika CL, Ahalya S, Kalpana SR, Kartha CC, Sumi S. Mechanoresponsive ETS1 causes endothelial dysfunction and arterialization in varicose veins via NOTCH4/DLL4 signaling. Eur J Cell Biol. 2024 May 11;103(2):151420. doi: 10.1016/j.ejcb.2024.151420. Epub ahead of print. PMID: 38759515.

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38759515/

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