OPM-293 CD05完全化學(xué)成分確定培養(yǎng)基應(yīng)用及培養(yǎng)流程
應(yīng)用范圍
OPM-293 CD05 即適用于科研應(yīng)用，也適用于基于細胞培養(yǎng)的大規(guī)模生物藥生產(chǎn)，但不可直接用于人體或作為藥 物使用。
儲存運輸方法
儲存：2~8℃冷藏，干燥避光保存
運輸：常溫（液體）、冷藏（干粉）
液體培養(yǎng)基配制方法
1. 取潔凈的配制容器，建議一次性配制體積不低于 1L；
2. 加入最終配制體積 90%的超純水或注射用水，水溫控制在 25~35°C；
3. 稱量 19.86g/L 干粉培養(yǎng)基，緩慢加入水中攪拌 10 分鐘；
4. 稱量 2.22g/L 碳酸氫鈉，加入水中攪拌；
5. 緩慢加入 5N NaOH 調(diào)節(jié) pH 到 8.3~8.5，攪拌 30 分鐘，此時應(yīng)完全溶解；
6. 緩慢加入 5N HCl 將 pH 調(diào)回至 7.0；
7. 定容到最終配液體積，繼續(xù)攪拌 5 分鐘，測 pH，用 5N NaOH 或 5N HCl 將 pH 調(diào)回至 7.0；
8. 取樣測滲透壓，加入 NaCl 調(diào)節(jié)滲透壓至 275±10mOsm/kg（滲透壓計算公式：NaCl 添加量（g）=配液體積 （L）*（275-檢測值）/31.5）；
9. 繼續(xù)攪拌 10 分鐘，無菌過濾到合適容器，2~8℃避光保存。
干粉及液體培養(yǎng)基質(zhì)量指標
培養(yǎng)條件
溫度 37℃，濕度 80%，5~8%CO2
搖床設(shè)置：轉(zhuǎn)速 115~125rpm（振幅 50mm）
細胞復(fù)蘇
1. 在 37℃水浴中快速（＜2min）融化冷凍的細胞；
2. 將冷凍管中的細胞液全部轉(zhuǎn)移到含有 30mL 預(yù)溫過的 OPM-293 CD05 培養(yǎng)基的 125mL 搖瓶中；
3. 放入 37℃，5~8% CO2，轉(zhuǎn)速 115~135rpm（振幅 50mm），濕度 80%的搖床中培養(yǎng)
細胞傳代
1. 將 OPM-293 CD05 培養(yǎng)基放入 37℃條件下預(yù)熱 20-30min。
2. 取細胞密度≥3×10 6 ~ 4×10 6cells/mL、活率≥95%、處于對數(shù)生長期中期的細胞進行傳代；注意：不同類 型的 HEK293 細胞可能具有不同的對數(shù)生長期范圍。
3. 按接種密度為 0.3×10 6 ~ 0.6×10 6cells/mL。
4. 無菌轉(zhuǎn)移所需量的種子液至合適體積的搖瓶中，并添加所需體積的已預(yù)熱的 OPM-293 CD05 培養(yǎng)基。
5. 將搖瓶放入溫度 37℃，濕度 80%，轉(zhuǎn)速 110-150rpm（振幅 50mm），5%~8%CO2的細胞培養(yǎng)搖床中進行培養(yǎng)。 *每 2~3 天用新鮮的培養(yǎng)基按上述步驟進行傳代培養(yǎng)。
細胞馴化
直接接種法
1. 對于可以直接馴化的細胞，可以從無血清培養(yǎng)基中直接接種到 OPM-293 CD05 培養(yǎng)基中，接種密度參考傳 代步驟。
2. 繼續(xù)傳代細胞，直到細胞穩(wěn)定生長。
3. 傳代幾代之后，細胞密度在接種的 3~4 天內(nèi)達到 3×10 6cells/mL、細胞活性≥95%。此時，可以認為細胞 已被馴化成功。
梯度馴化法
1. 如果直接馴化效果不佳，請嘗試按照以下梯度馴化表格進行操作。
2. 選擇低代次的細胞，并確保細胞處于對數(shù)期。
3. 使用原始培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，并繼續(xù)使用原始培養(yǎng)基傳代 2~3 代，以實現(xiàn)穩(wěn)定的細胞生長。
4. 在完全使用 OPM-293 CD05 培養(yǎng)基接種 3~4 天之后，VCD 應(yīng)該穩(wěn)定達到 3×10 6cells/mL，細胞活性≥95%。 此時，細胞已經(jīng)馴化到 OPM-293 CD05 培養(yǎng)基中。
轉(zhuǎn)染和瞬時表達
轉(zhuǎn)染條件應(yīng)根據(jù)具體情況進行優(yōu)化，可能需要通過 DOE 方法確定。以下轉(zhuǎn)染條件僅供參考
推薦的補料添加方案
推薦轉(zhuǎn)染流程
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