鐵死亡的熱度自不必多言， 近期，中研院分生所陳升宏課題組在 Nature 發表了研究，發現鐵死亡觸發波可導致大規模細胞死亡…… 

01
背景知識：觸發波與 FHN 模型

動感光波，biu biu biu？NO！是觸發波！！！ 

多細胞生物有時需要在遠距離上快速協調行為。咳咳，說人話……For Example！  經歷戰斗或逃跑反應的人類會在數秒內心率加快、瞳孔擴張、外周血管收縮。但這種情況是無法通過擴散、微管運輸、流動等通信方式實現的。

So，觸發波，一種反復出現的生物現象，在傳播過程中不會減慢或失去振幅，可快速可靠地遠距離傳輸信息。

觸發波：舉個栗子！

首先，最古老的生物觸發波——動作電位。

動作電位起源于軸突小丘 (圖 1a) 并以不減的速度和幅度沿軸突傳播 (圖 1b)。動作電位產生和傳播的關鍵蛋白質是電壓敏感的鈉通道 (圖 1c)。

其電路是一個相互關聯的正反饋和負反饋回路系統。反饋回路在蛋白質構象變化和離子流的水平上運行，這兩個過程都是非常快速的過程，這使得動作電位的峰值可以在不到 1 毫秒的時間內達到[1]。

圖 1. 生物觸發波的示例^[1]。

 

(a–c）動作電位。(a) 動作電位在軸突小丘處產生，并沿軸突向遠端傳播。(b) 通過一系列細胞外電極測量沿軸突傳播的動作電位記錄。動作電位期間 Na⁺ 向內流動記錄為細胞外電極記錄的電位負偏轉。(c) 產生動作電位的電路示意圖。(d–f) 受精卵中的鈣波。(d) 鈣波在精子入口處產生并擴散到整個卵子中。(e) 通過鈣綠加載后的比率成像測量乳狀帶蟲 Cerebratulus lacteus 母細胞中鈣濃度隨時間的變化。(f) 產生鈣波的電路示意圖。（g-i）非洲爪蟾卵中的有絲分裂波。（g）受精和受精后鈣波約 1 小時后，Cdk1 激活波從著絲粒附近擴散到細胞皮層。（h）非洲爪蟾卵提取物中的有絲分裂波。薄薄的聚四氟乙烯管中裝滿了循環的非洲爪蟾卵提取物以及精子染色質和核定位信號--綠色熒光蛋白標記。核膜破裂波從細胞質中最快的區域 (靠近這部分管的中間) 向外擴散。（i）產生細胞周期蛋白 B-Cdk1 激活波的電路示意圖。

  
當然，除了沿神經元軸突傳播的動作電位外，典型的例子還包括各種組織中的鈣波以及非洲爪蟾卵中的有絲分裂波。

雖然這三種情況下所涉及的蛋白質是互不相關的，但其輸出 (膜去極化、細胞內 Ca2+ 或細胞周期蛋白 B-Cdk1 活性) 都會通過觸發波在空間和時間中傳播。

動作電位：質膜去極化——電壓敏感鈉通道開放——鈉沿著其濃度和電位梯度向內涌入——膜進一步去極化，這構成了一個正反饋回路（圖 1C)。動作電位由兩個過程終止：電壓敏感性鉀通道的延遲開放，允許 K⁺ 流出細胞并恢復細胞內的凈負電荷，以及電壓依賴性鈉通道的自身失活（圖 1C)。

鈣波：與動作電位一樣，鈣波是由具有正反饋的電路產生的（圖 1F)。在這種情況下，細胞內游離 Ca²⁺ 的增加激活磷脂酶 C (PLC)，后者裂解磷脂酰肌醇 4,5 二磷酸 (PIP 2) 并生成第二信使肌醇三磷酸 (IP 3)。然后，IP 3 與充滿鈣的內質網 (ER) 上的 IP 3 受體 (IP 3 R) 結合，使 Ca²⁺ 流入細胞質并進一步激活 PLC（圖 1F)。因此，細胞內鈣離子的增加會引起細胞內鈣離子的進一步增加。此外，細胞內鈣離子通過調節內質網中的 IP 3 受體和阿諾定受體（Ryanodine receptor），更直接地刺激內質網鈣離子的釋放。因此，有兩個相互關聯的正反饋回路在相似的時間尺度上起作用。細胞內鈣離子的增加受到內質網有限容量的限制，然后被膜結合鈣泵逆轉，構成負反饋回路（圖 1F)。

有絲分裂波：產生有絲分裂波的電路如圖所示圖 1I。該過程以細胞周期蛋白 B-細胞周期蛋白依賴性激酶 1 (Cdk1) 復合物為中心，后者是有絲分裂的主要調節器。蛋白激酶 Cdk1 又受快速、相互關聯的正反饋和雙負反饋回路調控 （Cdk1 激活其激活劑 Cdc25C 并使其滅活劑 Wee1 失活)，從而構成雙穩態開關。然后，該開關由時間延遲的負反饋回路關閉；Cdk1 激活 APC/C Cdc20 復合物，這是一種泛素 E3 連接酶，可促進細胞周期蛋白 B 降解并使系統恢復到低 Cdk1 活性狀態。

物理助攻：FHN 模型

FitzHugh-Nagumo (FHN) 模型，一組物理學家熟知的方程。FHN 方程最初是作為 Hodgkin-Huxley 動作電位模型的簡化提出的，可看作是相互關聯的正負反饋回路的簡單通用模型，可以產生各種類型的動態響應，包括開關、脈沖和振蕩。此外，通過在 FHN 模型中添加擴散，可以產生觸發波，這些觸發波可快速傳播這些開關、脈沖和振蕩到很遠的距離。

此外，FHN 模型可以表現出三種類型的行為：雙穩態 (Bistability)、興奮性 (Excitability) 和振蕩 (Oscillations)。當與擴散等空間耦合機制相結合時，這些響應中的每一個都可以作為觸發波傳播[1]。  

02
鐵死亡再登 Nature



言歸正傳！近期，Nature 發表了題為：Emergence of large-scale cell death through ferroptotic trigger waves  的研究論文。該研究證明：鐵死亡，一種依賴于鐵和脂質過氧化的細胞死亡形式，可以通過活性氧 (ROS) 觸發波在人體細胞中以恒定速度（約 5.5 μm/min）長距離傳播 (≥ 5 mm)，由此引發大規模細胞死亡[2]。  

主要內容：
1. 鐵死亡可以通過活性氧 (ROS) 觸發波在人體細胞中以恒定速度 (約 5.5 μm/ min) 長距離傳播 (≥5 mm)。
2. ROS 反饋回路 (Fenton 反應、NADPH 氧化酶信號傳導和谷胱甘肽合成) 在控制鐵死亡觸發波進展中起主要作用。
3. 研究表明，通過抑制胱氨酸吸收引入鐵死亡應激可激活這些 ROS 反饋回路，將細胞氧化還原系統從單穩態轉變為雙穩態，從而使細胞群成為 ROS 傳播的雙穩態介質。
4. 此外，鐵死亡及其傳播伴隨著胚胎鳥類肢體肌肉重塑過程中大量但空間受限的細胞死亡事件，證實了其在胚胎發生過程中用作組織塑造策略。

本篇文獻使用 MCE 產品如下：

RLS-3 (HY-100218A)	鐵死亡誘導劑
Staurosporine (HY-15141)	鐵死亡誘導劑
GKT137831 (HY-12298)	NOX1/NOX4 抑制劑
Trolox (HY-101445)	ROS 清除劑

 

鐵死亡以觸發波的形式傳播

研究者使用了 RPE 細胞，其對藍光照射敏感，并在對年齡相關性視網膜變性期間表現出過度的鐵死亡。作者使用 MCE 鐵死亡誘導劑如 RSL3 (HY-100218A) 或 Staurosporine (HY-15141)處理后，鐵死亡開始并在 RPE 細胞中傳播。

圖 2. 鐵死亡在不同細胞類型中傳播^[2]。

RSL3 (0.15 μM) (a) 或 Staurosporine (0.15 μM) (b) 處理的 RPE-1 細胞中細胞死亡的延時圖像。顯示為明場和核染料熒光圖像與細胞死亡輪廓（橙色輪廓）疊加。

藍光照射會升高細胞 ROS，并促使經 Erastin  處理的 RPE 細胞隨后死亡。作者用藍光照射 Erastin 處理的細胞后，鐵死亡從光照區域開始，并以 5.52 ± 0.09 µm/min（平均值 ± 標準差）的恒定速度在 ≥5 mm 的距離內傳播。

圖 3. 鐵死亡通過脂質過氧化前以恒定速度在 RPE-1 細胞中傳播^[2]。

 

a-b. 鐵死亡從光誘導區域（紅色圓圈）開始，并在 18 小時內傳播至 5 毫米內經 Erastin 處理的細胞。輪廓（白色輪廓）表示特定時間點細胞死亡的邊界。a. 核染料熒光圖像（光誘導后 11 小時）與光誘導后 2-18 小時的輪廓疊加。b. 光誘導后細胞死亡的延時圖像，顯示 a 中橙色框的放大視圖。細胞破裂（明場）和核染料熒光增加（青色至白色）表示細胞死亡。c-d：數據來自 a，c：鐵死亡傳播的延時圖像陣列。d：鐵死亡傳播的動態圖。

 鐵死亡的一個標志是脂質過氧化的升高。作者使用脂質過氧化探針和通用 ROS 探針檢測羥基自由基 (•OH)、超氧化物 (O₂-) 和過氧化氫 (H₂O₂-) 均觀察到波長 (圖中 3a-b)，細胞 ROS（•OH、O2- 和 H₂O₂）波前先于鐵死亡傳播，且以類似于鐵死亡波的速度傳播。這表明鐵死亡通過觸發波而非簡單擴散進行傳播。此外，作者通過添加 MCE ROS 清除劑 Trolox (HY-101445)，發現其可阻止細胞死亡的傳播 (圖 4c)，這表明多種 ROS 可以共同促進驅動鐵死亡傳播的信號波前。
 

圖 4. 多種 ROS 可以共同促進驅動鐵死亡傳播的信號波前^[2]。

 

a-b. 脂質過氧化 (黃色) 和核染料熒光 (青色) 的合并圖像。使用 C11-BODIPY 581/591 監測脂質過氧化。黃色輪廓表示特定時間點脂質過氧化的邊界。a. 圖像 (光誘導后 7 小時) 與光誘導后 1-10 小時的輪廓疊加 (頂部)。底部，圖像底部區域量化的細胞死亡和脂質過氧化的熒光強度。b. a 中盒子的放大視圖。c. 在光誘導 4 小時后添加 ROS 清除劑如 MCE Trolox (6 µM) 后，Erastin 處理的細胞中細胞死亡傳播的動態圖 (白色箭頭)^[2]。

傳播機制

ROS 波前的形成需要兩個關鍵要素：(1) 細胞間 ROS 傳輸的空間耦合機制；(2) 細胞內 ROS 擴增機制 (例如，ROS 雙穩態)。作者驗證了 ROS 或 ROS 誘導分子的擴散不依賴于細胞與細胞之間的直接接觸。且在波停止的情況下，非起始區域邊緣的細胞表現出 ROS 積累 (圖 5)，推測可能是由來自波起始區域的鐵死亡細胞的擴散分子引起的。

通過實驗，研究者發現這些擴散分子可能是一類 ROS，且不太可能是 H₂O₂，更可能是過氧化脂質或其副產物。需要進一步研究來確定這些擴散 ROS 分子的身份。

圖 5. ROS 信號的擴散作為鐵死亡觸發波的耦合機制^[2]。

 

a. 在波起始區域 (左) 和非起始區域 (右) 之間產生間隙。細胞死亡 (青色) 和 ROS (黃色) 跨間隙傳播的延時圖像序列。使用 CellROX 染料監測 Erastin 處理的細胞中的 ROS。在特定時間點沿 2 mm 距離量化 ROS 的平均熒光強度。b. 波穿過不同間隙寬度 (35-380 微米) 的概率。

  
鐵死亡的傳播需要細胞間的 ROS 傳遞和細胞內的 ROS 放大，進而導致它們進一步產生擴散性 ROS 和鐵死亡細胞死亡。

至少有三個 ROS 反饋回路可能起作用以擴增鐵死亡網絡中的 ROS：谷胱甘肽 (GSH) 介導的雙負反饋回路和 Fenton 反應 32 和 NADPH 氧化酶 (NOX) 信號傳導的兩個正反饋回路 (圖 6a)。

為了研究這些反饋回路在調節鐵死亡傳播中的作用，作者通過化學擾動調節了它們的強度 (圖 6b)。
 

圖 6. ROS 反饋回路及化學干擾示意圖^[2]。 

芬頓反應由細胞中游離鐵驅動。它將 H₂O₂ 轉化為 •OH——一種高活性 ROS，可引發自催化脂質過氧化。使用鐵螯合劑去鐵胺 (Deferoxamine，DFO) 和鐵補充劑檸檬酸鐵 (Ferric citrate，FC) 擾亂了鐵水平。經 DFO 處理（80 µM）后，我們觀察到鐵死亡傳播速度降低。相比之下，通過 FC 提供游離鐵可加速鐵死亡傳播 (圖 7)。

圖 7. 化學干擾劑的核染料熒光圖像及對鐵死亡觸發波的影響。 

 

a．核染料熒光圖像 (光誘導后 11 h) 與細胞死亡輪廓疊加。黃色輪廓表示添加 DFO (80 µM) 的時間點。b.  核染料熒光圖像 (光誘導后 15 h) 與細胞死亡輪廓疊加。黃色輪廓表示添加 FC (250 µM) 的時間點。c-d. 添加鐵后，鐵死亡觸發波的速度增加。c.a 中實驗的動態圖。d. b 中實驗的動態圖。波速與DFO (e)、FC (f) 濃度的關系。

  
NOX 是產生細胞 ROS（O₂-和 H₂O₂）的主要酶類，活性酪氨酸激酶及其下游效應物 (如 PI3K) 可以激活 NOX 以進一步促進 ROS 生成。作者使用 MCE NOX1/NOX4 抑制劑 GKT137831 (HY-12298) 等三種抑制劑處理 RPE 細胞 (圖6b)，均減緩了鐵死亡的傳播 (圖 8a-c)，并呈現出劑量依賴性 (圖 8d-f)。
 

圖 8. MCE NOX1/NOX4 抑制劑 GKT137831 (HY-12298) 等對鐵死亡傳播的影響。

a-c. 添加 GKT137831 (1.25 µM)、LY294002  (100 µM) 或 Dasatinib (0.6 µM) 可減緩鐵死亡觸發波。d-f，波速與 GKT137831、LY294002 和 Dasatinib 濃度的關系。

 

除了化學干擾外，作者還通過過度表達 ERK2 來基因調節 NOX 信號的強度，鐵死亡波在 ERK2 過度表達的細胞中以更高的速度傳播，表明‍ NOX 介導的反饋回路在波傳播中起主要作用。‍

最后，作者建立了一個 ROS 觸發波的數學模型，該模型結合了 (1) 鐵死亡網絡中細胞內在的 ROS 反饋回路；和 (2) 簡單擴散作為細胞間的耦合機制。結果表明，Erastin 濃度的增加會導致 ROS 穩態的變化，即從單穩態轉換為雙穩態。ROS 通常在這種雙穩態范圍內以觸發波的形式傳播，進而加速鐵死亡傳播 (圖 9)。

圖 9. 鐵死亡應激使細胞啟動 ROS 雙穩態，并促進鐵質觸發波的傳播^[2]。

 

a、計算機模擬顯示 ROS 穩態與 erastin 濃度的關系。隨著 erastin 濃度的增加，ROS 穩態從單穩態 (低) 分為雙穩態 (黃色區域)。穩定的低和高 ROS 穩態和 USS 分別用藍色、紅色和白色圓圈表示。光誘導引起的 ROS 升高 (藍色箭頭，從藍色圓圈升高到黃色圓圈) 使細胞超過 USS，高于 USS 時 ROS 被放大（紅色箭頭）到高穩態。b、在不同 Erastin 濃度下光誘導 20 分鐘后的 ROS 熒光圖像 (黃色)。c. 增加 Erastin 濃度會促進 ROS 波前傳播。光誘導 6 小時后用不同濃度 Erastin 處理的細胞群中 ROS 傳播的模擬 (頂部) 和實驗 (底部)。

產品推薦

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BODIPY 581/591 C11  ODIPY 581/591 C11 常用于活細胞內脂質過氧化和抗氧化性能的研究，或與羥基自由基反應、檢測鐵死亡 (ferroptosis)。

H2DCFDA 經典的 ROS 檢測探針，可以很好的反饋細胞內 ROS 水平。

MitoSOX Red MitoSOX Red 是一種超氧化物指示劑，進入細胞后被激活，產品明亮的紅色熒光 。

 

參考文獻：
[1] Gelens L, et al. Spatial trigger waves: positive feedback gets you a long way. Mol Biol Cell. 2014 Nov 5;25(22):3486-93. 
[2] Co, H.K.C., et al. Emergence of large-scale cell death through ferroptotic trigger waves. Nature 631, 654–662 (2024).