在分子互作研究的復雜世界中，獲得更精確數據不僅是目標——而是必需。作為研究人員，您可能會遇到一些棘手問題：例如，我的實驗數據是否是真實的生物條件反映？是否有我未能察覺到的關鍵信息？我該如何檢測微弱的分子相互作用？等等。

在這種情況下，如果有一種技術可以保持樣本原生條件，可提供多個正交、互補的解析維度，而且最關鍵的是同時同步獲取多維讀數的技術就顯得尤為重要。層流誘導分散分析（FIDA）就是這樣一種技術。

FIDA可通過三個維度的生物物理參數對分子互作進行分析——分別是第一性原理的Rh（水動力學半徑），BRIC（結合依賴的熒光強度變化）和LD（Lambda Dynamics，光譜位移）。

• R_h（水動力學半徑）反應分子在溶液中的粒徑大小，FIDA通過第一性原理能夠獲得極其精確的絕對數值，分辨率低至1%的粒徑變化追蹤。分子粒徑是衡量分子結構最為重要的參數之一，FIDA對粒徑表征的高分辨率對于準確表征分子復合物至關重要。

• BRIC（結合依賴的熒光強度變化）作為一種基于熒光的讀數，BRIC敏感地反應結合引起的分子構象變化，構象變化作為分子結構完整性的補充（粒徑變化），BRIC顯得尤為重要。

• LD(Lambda Dynamics，光譜位移）指的是當結合事件改變熒光團或其他光學標記微環境時，檢測信號的波譜（lambda）發生的變化。這些變化為分子結合提供了額外的見解，提升了蛋白與小分子互作分析的解析度。

技術通過光譜位移（LD，Lambda Dynamics）、結合依賴的熒光強度變化（BRIC）和水動力學半徑測量（R_h），為解析分子相互作用提供了獨特的多維視角。這種整合提升了靈敏度和準確性，使得研究人員能夠在原生條件下檢測微小的分子變化和結合動力學，同時有效處理復雜樣品。這種綜合能力使FIDA在藥物開發和生物標志物驗證等領域具有廣泛的應用潛力。

下面將詳細介紹下BRIC（結合依賴的熒光強度變化）和LD（光譜位移）是如何捕捉更微弱的分子相互作用的。

BRIC（結合依賴的熒光強度變化）
什么是BRIC?
BRIC代表與結合依賴的熒光強度變化，是FIDA技術的一個重要方面。它測量當分子（如蛋白質或小配體）相互結合，或由于環境變化導致蛋白質改變其構象狀態時熒光強度的變化。

BRIC測量可視化
峰面積 = 強度（總熒光）

BRIC讀數提供了關于結合事件的信息，這些事件在復雜的生物環境中（如血清或細胞裂解液）可被靈敏的追蹤。對于用戶而言，BRIC與Rh可通過一次實驗同時獲得，后者提供了分子大小的絕對測量。擁有這兩種正交讀數使研究人員能夠更全面、多維地理解分子相互作用。

淬滅效應與BRIC
熒光淬滅是指由于各種因素（如分子碰撞、能量轉移或局部環境變化）導致分子（熒光團）的熒光減少的過程。當發生分子變化（如結合事件）時，例如配體結合到蛋白質上，它可以使熒光團靠近淬滅劑，或改變熒光基團周圍的微環境，從而導致熒光強度的變化。

BRIC利用這些熒光強度的變化來檢測和量化結合相互作用。具體而言：

• 環境變化：分子結合通常改變熒光基團周邊的極性、pH或其他特性，這可能增強或減弱熒光。BRIC測量這些強度變化，提供有關結合動態和分子相互作用的見解。

• 靜態淬滅：當結合事件導致熒光團和淬滅劑之間形成非熒光復合物時，熒光強度會下降。BRIC可以通過測量這種強度的降低來指示結合的發生。

總之，淬滅效應是BRIC檢測分子變化（例如結合事件）的基本方面。通過監測由于淬滅引起的熒光強度的減少（或增加），BRIC為研究分子相互作用的發生、強度和性質提供了寶貴的數據。這使BRIC成為在各種研究和藥物開發背景下研究生物分子相互作用的敏感工具。
 

在原生溶液條件中測量BRIC優勢
首先，BRIC信號測量不需要溫度變化（其他技術中使用溫度變化來誘導熒光變化）。重要的是要注意，熒光強度在變化條件下測量的技術中，例如涉及熱的技術，讀數可能會變得不可靠甚至無效，因為樣本的狀態發生了變化。由于在FIDA中溫度保持恒定，因此不會出現這種情況，條件保持原生。

其次，BRIC信號讀值會自動調整以考慮基質復雜性。也就是說，感興趣的信號被提取并從背景信號中分離，使得在復雜基質中容易進行實驗設計。

因此，從實際角度看，使用BRIC技術具有幾個關鍵優勢：

• 保持原生條件：BRIC允許在生理條件下研究生物分子相互作用，在和小分子互作研究中可測量無標記蛋白質的BRIC變化，而不必因溫度變化而破壞或改變分子的原生結構，從而提供更準確和可靠的數據。

• 與復雜介質的兼容性：BRIC在恒溫下測量相互作用，且考慮背景噪音的干擾，使BRIC在分析復雜介質（如血液或血清）樣本時尤其具有價值，在這些介質中，溫度變化可能會妨礙樣本的完整性，而這些樣本又具有高度的復雜性。（FIDA技術通常與復雜介質和各種緩沖液高度兼容。）

Lambda Dynamics（光譜位移）
什么是Lambda Dynamics？
LD（Lambda Dynamic）的核心在于捕捉分子在溶液中相互作用時發生的微小發射光譜變化。波長位移變化數據攜帶著有關相互作用動態的寶貴信息。更具體地說，光譜位移是指在結合事件改變熒光基團微環境時，檢測到的熒光信號波長（lambda）的位移變化。這些位移提供了關于結合相互作用的見解，并可能指示參與結合分子的構象、取向或接近度的變化。LD利用了被稱為“lambda比率測量”的原理（Alexander Damchenko，2010&2014）。正如Damchenko所指出的，LD在研究分子間相互作用時特別有價值，因為它提供了比單波長測量更可靠和詳細的讀數。

在實際操作中，LD采用了波長比率測量的核心理念，并應用于增強生物分子相互作用研究的深度和可靠性。獨特的背景扣除模式結合專有的FIDA技術，使得親和力Kd和溶液動力學Kon/Koff的準確性都提升到現有互作技術無法達到的水平。
 

FIDA LD與其他方法的比較

我們將FIDA LD與不同測量方法獲得的親和力常數（Kd）比較。Fida LD中的每個結合曲線點均以三次重復進行測量（其它技術由于本身限制無法提供連續三次技術重復）。

本次比較的親和力常數（Kd）是對應于酶碳酸酐酶與三種小分子抑制劑之間的相互作用。使用Fida Neo儀器獲得的Fida LD的Kd值與其他溶液方法和表面等離子體共振（SPR）接近。并且在三對樣品測量中均獲得穩定數據結果， Fida LD方法的其他的優勢包括快速的優化和測定、小樣本體積（納升-微升）以及附帶的全流程質量控制（QC）。

FIDA LD的獨特優勢
LD對于專注于分子相互作用研究的科研人員具有無與倫比的優勢：

1. 檢測其它技術無法檢測的：LD能夠檢測到其他測量或方法可能遺漏的微妙的波長位移。這種靈敏度的提高對于識別往往難以表征的復雜生物分子相互作用至關重要。

2. 效率：LD、BRIC、Rh同步進行測量：您可以通過一次實驗獲得三種測定結果。

3. 溶液動力學：與傳統方法可能僅提供Kd確定不同，波長動力學允許量化這些相互作用的動力學，從而提供對當前系統的更細致和深入的理解。

FIDA技術通過光譜位移（LD）、與結合依賴的強度變化（BRIC）和水動力學半徑測量（R_h），為解析分子相互作用提供了獨特的三維視角，這些優勢包括：

• 綜合的多維數據：FIDA通過同時測量這三個維度，能夠提供關于分子相互作用的更全面的理解。水動力半徑（R_h）提供了分子或復合物的絕對大小，BRIC則敏感地捕捉到結合事件引起的熒光強度變化，而光譜位移（LD）則揭示了分子環境的微小變化。這種結合使研究人員能夠從多個角度評估分子行為。

• 高靈敏度和準確性：FIDA的Rh可以檢測到低至1%的粒徑變化。BRIC則能夠識別在復雜生物環境中難以檢測的結合事件，而LD通過捕捉微小的光譜位移，進一步提高了對相互作用動態的敏感度。這種高度靈敏性使得研究人員能夠檢測到以前無法識別的復雜相互作用。

• 在原生條件下的分析：FIDA技術在恒定溫度下運行，保持了生物分子的原生狀態。BRIC和LD技術確保了在不干擾樣品的情況下進行測量，這對于維持樣品的結構和功能至關重要，特別是在復雜的生物介質中（如血清或細胞裂解液）。

• 動力學和親和力分析：通過波長變化，FIDA能夠提供關于結合動力學的實時數據，這有助于研究人員了解相互作用的速率和穩定性。同時，BRIC和Rh的結合也使得親

• 和力常數（Kd）測定更加準確，揭示了分子之間的結合強度。

• 適用于復雜樣品：FIDA在處理復雜樣品時表現出色，其LD和BRIC能夠自動扣除背景信號，確保從復雜的生物介質中提取出有意義的信號。這使得FIDA在藥物開發、蛋白質-蛋白質相互作用及生物標志物驗證等領域具有廣泛的應用潛力。

FIDA 平臺的選擇
FIDA平臺包括高通量、全自動的納升移液主機，以及配置的獨立的三個光學模塊，分別是紫外光學模塊用于Labelfree檢測，以及藍色和紅色光學模塊，與其它技術不同的是，FIDA主機可以靈活的配置最多三個光學模塊，也可配置單獨模塊與用于特定的研究。FIDA配置的靈活性可以滿足您當前的科研需求，而且方便的滿足后續的技術升級，最具特色的溶液自由動力學模塊也可以作為選擇進行靈活配置。

FIDA正在中國進行火熱的DEMO測試，如果您有任何分子互作技術上難以解決的問題，都可以聯系我們，我們非常有信心，憑借第一性原理的技術以及獨特的多維驗證技術，FIDA一定是您最值得信賴的互作技術！

關于文章的詳細內容，請參考FIDA官方網站，鏈接是：
https://www.fidabio.com/blogs

參考文獻
FIDA
Demchenko, Alexander. (2010). The Concept of λ-Ratiometry in Fluorescence Sensing and Imaging. Journal of fluorescence. 20. 1099-128. 10.1007/s10895-010-0644-y.

Demchenko, Alexander. (2014). Practical aspects of wavelength ratiometry in the studies of intermolecular interactions. Journal of Molecular Structure. 1077. 10.1016/j.molstruc.2013.11.045.

Myszka, David. (2004). Analysis of small-molecule interactions using Biacore S51 technology. Analytical biochemistry. 329. 316-23. 10.1016/j.ab.2004.03.028.

Langer, A. et al. (2022). A New Spectral Shift-Based Method to Characterize Molecular Interactions. Assay and drug development technologies. 20. 10.1089/adt.2021.133.