研究進展：單物鏡光片三維熒光成像技術的發展與應用
以傾斜平面照明和微鏡微器件反射技術為代表的單物鏡光片顯微技術突破上述限制，展示出在高分辨率和體積高速成像方面的優勢，并且可與超分辨顯微術等多種技術結合，在近年來取得了巨大發展。
中國科學技術大學的張一凡團隊發表綜述文章《單物鏡光片三維熒光成像技術研究進展（特邀）》，介紹了單物鏡光片顯微成像技術的原理、關鍵性能的提升和其在生物醫學的應用。
光片顯微鏡概述
光學顯微鏡是生命科學研究的重要工具。20世紀80年代，共聚焦顯微鏡和雙光子顯微鏡出現，賦予了顯微鏡三維解析能力，但存在光毒性和光漂白問題。
2004年，光片顯微鏡（LSM）出現，其激發光經柱透鏡在樣品上形成光片，限制了照明范圍，減少了光損傷和光漂白。2008年，數字激光掃描顯微鏡（DLSM）是另一種形成光片的方法。
傳統光片顯微鏡由照明光路和探測光路組成，通常需要兩個正交的物鏡。但雙物鏡的使用帶來了一系列問題，如樣品裝載手段復雜、不能使用常用載玻片、限制樣品種類和安裝，需要物鏡有較長工作距離，限制了高分辨率圖像的獲得，兩個光路間還需要精確對焦。
而以傾斜平面照明和微鏡微器件反射技術為代表的單物鏡光片顯微技術突破了上述限制，并展示出了在高分辨率和體積高速成像方面的優勢。
單物鏡光片顯微鏡技術原理
傾斜平面照明顯微鏡（OPM）
2008年，Dunsby發明了傾斜光片照明顯微鏡。它把柱透鏡生成的片狀照明光引入原先探測物鏡的光路，同時在成像光路中設計了遠程聚焦系統，引入二級和三級物鏡來復制和成像樣本的三維信息。
三維成像掃描方式
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移動載物臺掃描：這是一種常見的方法，通過移動載物臺使光片掃過樣品各部分。但它有很多缺點，比如受樣品體積限制，運動不穩定會耗時，還會引入運動偽影影響圖像質量。后來Kumar等進行了改進，把物鏡壓電移動平臺安裝在二級物鏡處，通過移動二級物鏡來改變光片位置實現三維掃描，提高了成像速度。
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利用檢流計振鏡掃描：這種方法可以使照明光片快速掃過樣本。例如Bouchard等開發的平面掃面共焦（SCAPE）顯微鏡，利用定制六邊形振鏡大大提高了三維成像速度。之后還有很多改進的掃描方式，像SOPI-OPM、SCAPE 2.0等，它們在提高速度的同時也不斷優化成像效果。
多視圖光片成像
在實際成像過程中，光片穿過樣品會因為散射、吸收等問題導致光衰減，尤其是在腦組織等復雜生物樣品中，散射會讓圖像質量下降很快。多視圖光片顯微鏡就可以解決這個問題，它利用兩個或多個不同方向的光片照明，獲得多個視角的圖像，再通過圖像融合算法把這些圖像組合起來，減少散射引起的偽影，得到各向同性分辨率的圖像。
基于微鏡反射的單物鏡光片顯微鏡
針尖微懸臂反射鏡
2013年，Gebhardt等開發了利用原子力顯微鏡（AFM）臂的反射型光片顯微鏡，斜入射的光片在壁上反射照明樣品。2018 年，Ponjavic等利用原子力顯微鏡的單臂也開發了一種單物鏡光片顯微鏡。
微流控制備微反射鏡器件
2015年，Galland等設計了一款特別的單物鏡光片顯微鏡。它不需要遠程聚焦系統，光片方向垂直于物鏡光軸。它使用定制的樣品裝載容器，把45°反射微鏡放在硅片的微孔里。照明光束從物鏡后焦面斜入射，經反射后形成垂直光軸的照明光片。這個顯微鏡還可以和倒置商用標準顯微鏡兼容，能使用多種物鏡，生成不同厚度的光片，滿足多種尺度的研究需求。
單物鏡光片顯微鏡關鍵性能提升
空間分辨率
OPM雖然解決了正交光片顯微鏡不能使用高數值孔徑物鏡的問題，但實際使用中，物鏡的高數值孔徑并不能完全被利用。這是因為照明光束會分占一部分數值孔徑，而且遠程聚焦系統中第二物鏡與第三物鏡傾斜放置，導致光不能完全中繼到第三物鏡上。
成像視場
三級物鏡遠程聚焦系統對顯微鏡的視場范圍有影響。光片顯微鏡的軸向分辨率和視場是相互制約的。在傾斜光片顯微鏡中，遠程聚焦系統是視場限制的主要原因。
為了增大視場，研究人員想出了很多方法，比如擴展平面成像、利用反射閃耀光柵、利用Scheimpflug條件等，還有一些新穎的方案是取消遠程聚焦系統。
單物鏡光片顯微鏡在生物醫學的應用
傾斜平面照明顯微鏡的生物醫學應用
光片顯微鏡因為光毒性低，常被用于活體胚胎等大樣本的長時間發育成像。單物鏡光片顯微鏡更是把振鏡掃描方式引入光片顯微鏡的三維成像，極大地提高了體積成像速度。
這對于神經活動、心臟跳動及血流動力學等高速生命活動的觀測非常有幫助。比如可以對心臟中的鈣火花進行3D成像，觀察心肌細胞收縮活動中的鈣波傳輸等。
它還可以用于高通量成像，像結合聲流控聚焦設計多色3D成像流式細胞術，同時對多個細胞進行檢測。在醫學檢驗方面，也有應用，比如開發了Medi-SCAPE用于活體腫瘤監測，還應用于眼科成像，對眼底視網膜進行三維成像，檢測血流動力學等。
基于微鏡反射的單物鏡光片顯微鏡的生物醫學應用
這類顯微鏡可以使用高NA物鏡對多孔板進行成像，移動位移臺時不需要重新聚焦樣品。
單物鏡光片顯微鏡的超分辨成像拓展
單分子定位超分辨成像
典型的單分子方法如STORM，單分子超分辨方法中熒光信號微弱，圖像信噪比越高，單分子定位精度越高。光片顯微鏡具有低背景熒光的優勢，與單分子定位技術結合后，可將厚樣本納入研究范圍，在多種單物鏡光片架構中都有應用。
結構光照明超分辨成像
SIM超分辨顯微術具有相對較快的速度，與光片技術常用于活細胞的成像場景。單物鏡的架構為結構光帶來了新機遇，如2022年Chen等的設計用一個帶有振鏡與靜態鏡組合的圖像旋轉器的單物鏡光片顯微鏡，可獲得各向同性的超分辨圖像。
結論與展望
光片顯微鏡因光學切片及與多種光學技術的適用性而迅速發展。單物鏡光片顯微術有諸多優點，解決了傳統光片顯微鏡的載玻片使用、幾何空間限制及正交光片顯微鏡不能用高NA物鏡的問題，聯合超分辨成像技術后分辨水平進一步提升，推動了其在生物學實驗室的應用，適用于高速生命活動觀察和在體成像場景，是快速體積成像利器。
