使用染料PHK 26進行體外細胞的標記和追蹤
本期要和大家分享的是我們的客戶文獻: “Gouqi-derived nanovesicles (GqDNVs) inhibited dexamethasone-induced muscle atrophy associating with AMPK/SIRT1/PGC1α signaling pathway” (枸杞衍生的納米囊泡在對抗肌肉萎縮中的作用) 這項創新研究發表在 J Nanobiotechnology (IF=10.42)。
該文獻使用了 PKH 26 (MedChemExpress) 進行研究，這是一種紅色熒光染料，已被證明對體外細胞標記和追蹤非常有用。
在這項研究中，研究人員成功追蹤了 C2C12 細胞中 GqDNVs 的細胞攝取，證明了染料能夠清晰地可視化細胞過程。結果顯示攝取率為 56%，并強調了 GqDNVs 在改善肌肉功能方面的作用。
01
案例分享：J Nanobiotechnology
背景介紹：
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隨著全球老齡化趨勢加劇，肌肉減少癥已成為重大的公共衛生問題。肌肉減少癥是一種進行性、廣泛性的骨骼肌疾病，是指隨著年齡增長而導致的骨骼肌質量和功能的損失。
- 枸杞，在中國又稱為“枸杞子”，是一種傳統中藥，可以增強肌肉和骨骼的結構和功能。此外，先前的研究表明，植物衍生的外泌體類納米顆粒可以在不同的衰老或疾病模型中發揮良好的生物活性作用。
- 該研究探索了枸杞衍生納米囊泡 (GqDNV) 在對抗與年齡相關的肌肉萎縮方面的潛力。作者成功利用 PKH 26 (紅色熒光，MedChemExpress) 染料推進研究，并取得了顯著成果！
提取 GqDNV
首先，采用超速離心和密度梯度離心相結合的方法，從新鮮枸杞 (寧杞 7 號) 中提取 GqDNV (圖 1)。
其次，通過 NTA (Nanoparticle tracking analysi, 納米顆粒跟蹤分析) 和透射電子顯微鏡觀察發現 GqDNV 為細胞外囊泡，呈“杯盤”狀，大小為 127.8±1.3 nm (圖 2)。
圖 2. GqDNVs 的的透射電鏡圖[1]。
此外，研究人員還利用 C2C12 細胞，測試了 C2C12 細胞中的細胞活力、ATP和線粒體膜電位。
02
他們如何利用 PKH 26 進行細胞研究？
PKH 26 是一種紅色熒光染料，可與細胞膜的脂質區域結合。它能夠發出紅色熒光 (Ex/Em=551/567 nm)，因此成為體外細胞標記和追蹤研究的重要工具。
在細胞攝取試驗中，他們使用 PKH 26 (紅色熒光，MedChemExpress) 跟蹤 GqDNV 的細胞內吞過程。此外，C2C12 細胞的細胞骨架用異硫氰酸熒光素 (FITC) 鬼筆環肽 (Phalloidin) (綠色熒光) 顯示，細胞核用 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI) (藍色熒光) 標記。同時，還使用流式細胞熒光分選技術 (Fluorescence activated Cell Sorting, FACS) 來測量 C2C12 細胞攝取 PKH 26 標記的 GqDNV 的數量。
PKH 26 跟蹤 GqDNV 的細胞內吞過程
(1) GqDNVs 用 PKH 26（紅色熒光，MedChemExpress）標記。
(2) 將 PKH 26 溶解于二甲基亞砜 (Dimethyl sulfoxide, DMSO) 中，得到 1 mM PKH 26 儲備溶液。用 PBS 以 1:100 稀釋儲備溶液，得到 10 μM 工作溶液。
(3) 將 GqDNVs 與工作溶液在室溫下孵育 30 min，然后在 150,000×g下超速離心 1.5 h，得到 PKH 26 標記的 GqDNVs。
(4) 將 PKH 26 標記的 GqDNVs 與 C2C12 細胞在 37 °C 黑暗條件下孵育 6 h。孵育后，收獲細胞并用 PBS 清洗以去除游離顆粒。
(5) C2C12 細胞的細胞骨架用異硫氰酸熒光素 (FITC) 鬼筆環肽 (Phalloidin) (綠色熒光) 標記，細胞核用 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI) (藍色熒光) 標記。這些染料能夠有效準確地追蹤 GqDNV 的細胞內吞過程。
(6) 通過點掃描激光共聚焦 (FV3000) 觀察 C2C12 細胞對 GqDNVs 的內吞作用。
將 PKH 26 染色的 GqDNV與 C2C12 細胞共培養 6 h 后，研究人員通過熒光共聚焦顯微鏡觀察到 GqDNV 被 C2C12 細胞攝取 (圖 3)。表明 GqDNVs 可被 C2C12 細胞吸收。
圖 3. C2C12 細胞和 GqDNVs 的熒光共聚焦顯微鏡圖[1]。
PKH 26 標記 GqDNVs (紅色熒光)；FITC 染色 C2C12 細胞骨架 (綠色熒光)；DAPI 染色 C2C12 細胞核 (藍色熒光)；合并圖是三個熒光圖像的重合圖。
FACS 測量 ：C2C12 細胞攝取 PKH 26 標記的 GqDNVs 的數量
(1) 將 C2C12 細胞接種在含有 2 mL 培養基的 6 孔板中，分為三組 (空白組、陽性組和 GqDNVs)。
(2) 將 C2C12 細胞在空白組 (PBS)、陽性組 (10 μM PKH 26) 和 GqDNVs 組 (PKH 26 標記的 GqDNVs) 中孵育 6 h。
(3) 使用全光譜分析流式細胞術 (ID 7000) 測量具有陽性熒光的 C2C12 細胞的數量。
實驗結果
流式細胞熒光分選技術（FACS）顯示熒光陽性的 C2C12 細胞數量為 56％ (圖 4)。
圖 4. FACS 分選后 PKH 26 標記的 GqDNVs 處理的 C2C12 細胞中熒光陽性細胞數量的代表[1]。
a：PBS 處理的 C2C12 細胞 (空白組)。b：PKH 26 標記的 C2C12 細胞 (陽性組)。c：PKH 26 標記的 GqDNVs 處理的 C2C12 細胞 (GqDNVs 組)。a-c：縱坐標 (Events) 上的數字表示細胞數。橫坐標顯示熒光強度。圖上的百分比表示熒光陽性的 C2C12 細胞占總細胞數的百分比。
該研究的其他主要發現：
- GqDNVs 可以促進 Dexamethasone 給藥的 C2C12 細胞中肌管的直徑。
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GqDNV 影響肌肉中成肌因子 5 (MYF5)、肌生成素 (MYOG) 和成肌分化 (MYOD) 蛋白的表達水平，這與 AMPK/SIRT1/PGC1α 通路相關。
- 本研究還檢測了 GqDNVs 在小鼠體內的分布情況，發現 GqDNVs 注射到小鼠股四頭肌后，能夠被肌肉吸收。
- GqDNVs 能減輕 Dexamethasone 引起的小鼠骨骼肌萎縮,改善小鼠骨骼肌功能。在肌萎縮模型小鼠中,肌肉注射 GqDNVs 可增加股四頭肌的橫截面積、握力及 AMPK/SIRT1/PGC1α 通路的表達。
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此外，股四頭肌能量靶向代謝組分析表明，GqDNVs 上調氨基糖和核苷酸糖的代謝、自噬和氧化磷酸化過程，從而激活肌肉再生。
03
小結
在這項研究中，客戶使用 PKH 26 (MedChemExpress) 成功追蹤了 C2C12 細胞中 GqDNVs 的細胞攝取，展示了染料能夠清晰地可視化細胞過程，證實了GqDNVs 可被 C2C12 細胞吸收。 不知如何下手的小伙伴們可以學起來啦~
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參考文獻：
[1] Zhou X, et al. Gouqi-derived nanovesicles (GqDNVs) inhibited dexamethasone-induced muscle atrophy associating with AMPK/SIRT1/PGC1α signaling pathway. J Nanobiotechnology. 2024 May 22;22(1):276.
