神經遞質系統通過直接或間接調控神經元活動，在認知和行為過程中發揮關鍵作用。非人類靈長類動物（NHPs）研究因缺乏可靠測量多種神經遞質的方法，難以捕捉這種復雜性。微透析（Microdialysis，MD）技術可在體內測量腦組織中多種分子濃度，但在 NHPs 應用較少。該研究旨在開發一種新型半慢性微透析技術，結合高靈敏度分析手段，實現在清醒NHPs中多神經遞質的同步測量與動態比較。
 

該研究的作者團隊由來自倫敦大學的Stella Mayer、Iryna Danylenko、Viktoria A. Misiak、John C. Rothwell以及來自英國醫學研究委員會分子生物學實驗室的Seth G. Grant組成。他們憑借在神經科學、實驗技術等多個領域積累的深厚專業知識，進行了在清醒恒河猴上建立體內腦微透析技術的研究。

研究人員通過半慢性微透析（MD）采樣，對比動物 “活躍” 和 “非活躍” 兩種行為狀態下六種神經遞質及膽堿的濃度。實驗時，動物坐在特制靈長類座椅上，頭部活動受限，使用眼動儀監測眼動，刺激呈現在動物前方的顯示器上。當動物未參與行為任務（如因困倦或缺乏動機）時為非活躍狀態，參與任務時為活躍狀態。
 

圖1 恒河猴半慢性 MD 系統示意圖

注：標準的 MD 設置包括一個導向器和一個探針，探針的尖端有一層半透膜，放置在感興趣的大腦區域（圖 1）。該膜允許分子在低于膜的截留分子量值時，從細胞外空間（高濃度區域）到探針內部（低濃度區域）的凈擴散。入口和出口管分別允許用人工腦脊液 （aCSF） 灌注探針和收集樣本。

研究人員選用1只19歲、13.5 kg的成年雄性恒河猴作為研究對象進行實驗，為了確定皮質神經遞質的濃度，使用CMA 12 Elite探針從位于上顳溝后岸的 MT 區域的三個不同位置（TR-1、TR-2、TR-3）（圖3 A）采集細胞外液樣本進行實驗。該研究采用新方法，即通過可拆卸插入物半慢性植入 MD 導管和探針。該插入物由生物相容性樹脂 3D 打印而成，放置在標準 PEEK （聚醚醚酮）記錄室內，其結構設計有助于固定導頭、清潔腔室和防止探針位移。MD 導管由聚氨酯制成，帶可拆卸尖頭不銹鋼針，MD 探針為定制不銹鋼軸，探針半透膜由 PAES 制成，可確保采樣穩定。通過使用插入物將探針半慢性植入目標區域后，利用注射泵裝置，把 aCSF泵入入口管，選擇 1 μL/min 的灌注速率進行灌流，以此平衡時間分離度和分析物回收率。該實驗12min收集一次樣品，樣品收集完成后使用MRI 掃描驗證探針位置后對樣本進行檢測分析。

圖2 用于 MD 采樣的三種 MT 軌跡（TR-1、TR-2 和 TR-3;TR=trajectory）

圖3 用于 MD 采樣的三種 MT 軌跡（TR-1、TR-2 和 TR-3;TR=trajectory）

樣品收集完成后，研究人員采用超高效液相色譜-電噴霧電離-質譜法（UHPLC-ESI-MS），以低樣品量（每個樣品 12μL）對 18 個樣品（9 個活躍狀態、9 個非活躍狀態，18 天內收集）中的 6 種神經遞質（DA、NE、LE、5-HT、Glu、GABA）和膽堿的相對濃度進行量化。為控制小樣品化合物組成可能產生的誤差，在三個時間點測量，每種化合物均測量三次。結果顯示，多數樣品的誤差不超 20%，如 GABA、谷氨酸、膽堿、去甲腎上腺素、血清素等大部分樣品誤差在相應較低范圍內；腎上腺素和多巴胺部分樣品誤差相對較高。

研究人員通過對細胞外液中神經遞質濃度值的額外分析，進一步驗證了在恒河猴 MT 區域采樣和檢測神經遞質的方法，并展示了 “活躍” 和 “非活躍” 狀態下 GABA、谷氨酸等神經遞質及膽堿濃度的頻率直方圖。

圖4 七種神經遞質濃度的頻率分布

后續進一步計算了每種神經遞質在不同行為狀態下的變異系數（CV）并針對每個樣本，計算各神經遞質對之間的 Spearman 相關性，以此探究神經遞質的共調節和動態相互作用。結果顯示 “活躍” 狀態下的 CV 值始終高于 “不活躍” 狀態，這可能反映出恒河猴在 “活躍” 狀態下行為表現的變異性更大，而 “不活躍” 狀態相對穩定、喚起水平較低；“活躍” 狀態時，多巴胺、膽堿、去甲腎上腺素、谷氨酸和血清素等神經遞質間存在顯著正相關，意味著這些神經遞質的濃度變化具有一致性，可能共同參與并依賴于猴子的任務執行和行為表現；“不活躍” 狀態下，GABA 與其他神經遞質存在顯著相關性，其中與膽堿、腎上腺素呈強正相關，與去甲腎上腺素呈強負相關，表明 GABA 在 “不活躍” 狀態下對其他神經遞質的調節作用突出，反映出該狀態下神經元活動的抑制性調制增強。

圖5 活躍” 和 “不活躍” 行為塊樣本中七種神經遞質的濃度值，以及這兩種行為塊的變異性（CV）測量結果
 

圖6  Spearman 在“活躍”和“非活躍”狀態下的相關性

透析技術能在體實時采集生物樣本，精準測定神經遞質、代謝物等多種生物分子的動態變化，為探究大腦神經化學機制、疾病病理生理過程以及評估藥物療效等研究提供關鍵數據支撐，有力推動了神經科學、藥理學和臨床醫學等多領域的發展。在此基礎上，研究人員運用新型半慢性腦微透析技術，對清醒恒河猴不同認知狀態下大腦皮層神經遞質的濃度變化展開研究。結果表明，“活躍” 狀態下神經遞質濃度的變異性更高，其中 GABA 和 5-HT濃度顯著增加，這一發現揭示了神經遞質在認知功能中的動態調節作用，為相關神經疾病研究開拓了新視角。

參考文獻：Mayer S, Saxena P, Crayen MA, et al. Establishing In-vivo brain microdialysis for comparing concentrations of a variety of cortical neurotransmitters in the awake rhesus macaque between different cognitive states. J Neurosci Methods. 2025 Mar;415:110361.

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