Protection of neutrophils by bone marrow mesenchymal stromal cells is enhanced by tumor-associated inflammatory cytokines

Keywords: G-CSF; inflammation; mesenchymal stromal/stem cells; neutrophil; tumor progression.

間充質基質細胞（MSCs），也稱為間充質干細胞，是許多組織中必不可少的細胞成分，有助于組織修復和體內平衡。除了產生成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞外，MSCs 還表現出強大的免疫抑制作用。研究表明，MSCs 可以通過對適應性免疫系統細胞（如 T 細胞和 B 細胞）的免疫抑制作用來促進腫瘤生長和進展。MSCs 遷移到腫瘤部位后，也被證明可以通過募集單核細胞/巨噬細胞來促進腫瘤生長。

中性粒細胞是骨髓中的主要細胞成分，由干細胞增殖和分化為成熟的中性粒細胞。研究表明，中性粒細胞參與腫瘤進展。然而，目前尚不清楚 MSCs 是否以及如何在腫瘤進展過程中影響中性粒細胞。

基于此，溫州醫科大學大分子藥物與規�；�制備全國重點實驗室及浙江大學醫學院附屬第二醫院婦科研究團隊檢測了荷瘤小鼠骨髓中的 MSCs 和中性粒細胞，并在體外測試了 MSCs 對中性粒細胞的影響。研究發現 MSCs 保護中性粒細胞免于凋亡，并促進中性粒細胞成熟，可能是通過產生 G-CSF 來實現的，且荷瘤小鼠血清中升高的炎性細胞因子 IFNγ 和 TNFα 可以顯著刺激 MSCs 產生更多的 G-CSF。這些發現表明，MSCs 可以影響中性粒細胞，并可能為腫瘤免疫治療提供潛在的治療靶點。研究成果發表在 Frontiers in Immunology 期刊題為“Protection of neutrophils by bone marrow mesenchymal stromal cells is enhanced by tumor-associated inflammatory cytokines”。

首先，為了確定骨髓中的 MSCs 是否可能影響中性粒細胞，評估了野生型（WT）和荷瘤小鼠（10 周齡 MMTV-pyMT）中的 MSCs 和中性粒細胞。與對照組相比，荷瘤小鼠中 MSCs 的百分比和絕對數量增加，表明骨髓中的 MSCs 對腫瘤進展有反應。來自骨髓的 MSCs 進一步表征為 CD73- CD45- CD11b- Sca1+ CD44+ CD29+。有趣的是，與對照組相比，荷瘤小鼠的中性粒細胞也相應地富集。這些數據表明，MSCs 和中性粒細胞在荷瘤小鼠的骨髓中均升高。

值得注意的是，與野生型小鼠相比，荷瘤小鼠的中性粒細胞核分葉（nuclear segmentation）顯著增加（圖1 A），表明 WT 和 PyMT 小鼠之間中性粒細胞特征存在潛在差異。為了說明 PyMT 和 WT 小鼠乳腺中中性粒細胞之間的差異，進一步分析了 GSE164766 的 RNA-seq 基因表達，結果顯示，2877 個基因（832 個顯著下調和 2045 個顯著上調）在兩組之間差異表達（圖1 B）。KEGG 分析顯示，基因集的變化與 MAPK 信號通路、NF-kappa B 信號通路和 PI3K-Akt 信號通路密切相關（圖 1 C）。然后，對 2877 個 DEGs 進行了 GSEA 分析，顯示上述三種通路的基因特征在 PyMT 組中顯著富集（圖1 D、E）。通路圖顯示，與細胞周期、存活和炎癥相關的基因調控因子上調，提示荷瘤小鼠來源的中性粒細胞可能具有更強的增殖、抗凋亡和促瘤能力。

圖1 鑒定源自 WT 和 PyMT 小鼠的中性粒細胞之間的 DEG。

接下來，為了探討 MSCs 對中性粒細胞的可能影響，分別從骨髓中分離出中性粒細胞和 MSCs，共培養 24 小時。有趣的是，當與 MSCs 共培養時，反映細胞凋亡的 Annexin V + 中性粒細胞顯著減少（圖2 A）。一致地，共培養物中剩余的中性粒細胞更多（圖2 B）。此外，在共培養中，中性粒細胞更成熟，反映在細胞核分葉的增加（圖2 C）。這些數據表明，MSCs 可能充當骨髓中中性粒細胞的保護者，使其免于凋亡并促進成熟。

圖2 MSCs 減少中性粒細胞凋亡并促進中性粒細胞成熟。

進一步地，實驗確定了 MSCs 對中性粒細胞的保護作用是否是由 MSCs 產生的可溶性因子介導的。為此，在有或沒有 MSC培養基（MSC-CM）的情況下培養中性粒細胞。與對照組相比，MSC-CM 減少了中性粒細胞凋亡并防止了中性粒細胞的丟失（圖3 A、B），表明來源于 MSCs 的某些細胞因子可能介導了保護作用。

粒細胞集落刺激因子（G-CSF）和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）均能促進中性粒細胞的產生，直接對中性粒細胞起作用而增強該細胞的功能。因此，檢測了 MSCs 條件培養基中 G-CSF 和 GM-CSF 的水平，發現與檢測不到兩者水平的對照組相比，MSCs 上清液中只有 G-CSF 升高（圖3 C）。此外，荷瘤小鼠血清中的 G-CSF 水平較高，但在 WT 組中檢測不到（圖3 D）。有趣的是，作為關鍵炎性細胞因子的 IFNγ 和 TNFα 水平在荷瘤小鼠中也顯著增加（圖3 D）。

為了測試腫瘤相關的 IFNγ 和 TNFα 是否可以刺激 G-CSF 的產生，使用這兩種細胞因子處理 MSCs，發現用 IFNγ 和 TNFα 聯合處理的 MSCs 在 mRNA 水平和蛋白質水平上比未處理或用單一細胞因子處理的 MSCs 產生更多的 G-CSF（圖3 E），表明 MSCs 可能通過產生 G-CSF 對中性粒細胞發揮保護作用，并且 MSCs 中的 G-CSF 表達在腫瘤微環境特征的炎癥條件下進一步上調。這些數據表明，G-CSF 在 MSCs-中性粒細胞軸中起關鍵作用。

圖3 TNFα 和 IFNγ 誘導 MSCs 產生更多的 G-CSF。

最后，研究驗證了 IFNγ 和 TNFα 處理的 MSCs 是否可以更有效地保護中性粒細胞，發現用 IFNγ 和 TNFα 處理的 MSCs 確實顯示出減少的中性粒細胞凋亡，且維持中性粒細胞數量的能力增強（圖4 A、B）。利用抗體阻斷 G-CSF 可以減弱對中性粒細胞的保護作用（圖4 C）。此外，在暴露于 IFNγ 和 TNFα 處理的 MSCs 的中性粒細胞中觀察到更多的分葉過多的細胞核，但當使用抗體消除 G-CSF 信號時，則沒有這種影響（圖4 D）。這些數據表明，IFNγ 和 TNFα 誘導的 MSCs 可以通過 G-CSF 信號進一步保護中性粒細胞并促進其成熟。

圖4 IFNγ 和 TNFα 處理的 MSCs 顯示出更強的減少中性粒細胞凋亡和促進中性粒細胞成熟的能力。

總之，該研究結果表明，骨髓 MSCs 可以在體外保護中性粒細胞免于凋亡，并促進其分化為多分葉中性粒細胞，在炎癥條件下，MSCs 可以產生更多的 G-CSF 來富集中性粒細胞，發揮越來越強的保護作用，表明 MSCs 可能在骨髓中性粒細胞的形成中發揮關鍵作用。總之，這些結果為骨髓中 MSCs 在炎癥和腫瘤發生過程中的潛在功能提供了見解。

參考文獻：Liang Y, Lou X, Xu Y, Zheng Z. Protection of neutrophils by bone marrow mesenchymal stromal cells is enhanced by tumor-associated inflammatory cytokines. Front Immunol. 2024 Apr 16;15:1361596. doi: 10.3389/fimmu.2024.1361596. PMID: 38690266; PMCID: PMC11058655.

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38690266/

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Electronic ISSN 1664-3224

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