摘要
通過威尼德電穿孔儀優化轉染參數，實現外源基因高效導入大鼠肌衛星細胞。實驗結果顯示，電穿孔電壓260 V、脈沖時長5 ms時轉染效率達68.5%，細胞存活率>80%。Western blot證實目的蛋白穩定表達，表明該方法具有可行性，為肌肉再生研究提供技術支持。
引言
骨骼肌損傷修復依賴肌衛星細胞的增殖與分化能力，而基因編輯技術是調控其功能的重要手段。傳統化學轉染法存在效率低、細胞毒性強等問題，病毒載體則伴隨生物安全風險。電穿孔技術通過瞬時電場改變細胞膜通透性，具有操作簡便、適用范圍廣的特點，但其在肌衛星細胞中的轉染參數尚未系統優化。
研究以原代大鼠肌衛星細胞為模型，利用威尼德電穿孔儀探索最佳轉染條件，結合分子生物學手段驗證外源基因表達效率，為后續功能研究奠定基礎。
一、材料與方法
1. 細胞分離與培養
取8周齡SD大鼠后肢骨骼肌，經膠原酶/分散酶（某試劑）消化后，采用差速貼壁法純化肌衛星細胞。細胞接種于含15%胎牛血清（某試劑）、1%雙抗的DMEM培養基，于37℃、5% CO₂條件下擴增至第3代用于實驗。
2. 質粒構建與驗證
采用pEGFP-N1質粒（某試劑）作為報告基因載體，經威尼德紫外交聯儀（紫外線強度3000 μJ/cm²）進行線性化處理。通過1%瓊脂糖凝膠電泳及Nanodrop（某試劑）檢測質粒濃度與純度（A260/A280=1.8-2.0）。
3. 電穿孔參數優化
將1×10⁶細胞與10 μg質粒混合于電轉杯，使用威尼德電穿孔儀進行梯度實驗：
電壓組：200 V、240 V、260 V、280 V
脈沖時長組：3 ms、5 ms、7 ms
脈沖次數：單次與雙次脈沖對比
轉染后細胞立即轉移至預溫培養基，24 h后觀察熒光表達。
4. 檢測方法
流式細胞術：收集轉染48 h細胞，使用BD FACSCalibur分析EGFP陽性率。
細胞活性檢測：CCK-8試劑（某試劑）測定轉染后24 h、48 h存活率。
Western blot：RIPA裂解液（某試劑）提取總蛋白，經10% SDS-PAGE分離后轉膜，Anti-GFP抗體（某試劑）檢測目的蛋白表達。
結果
1. 參數優化結果
260 V/5 ms單脈沖條件下，流式檢測轉染效率達68.5±3.2%，顯著高于其他組（P<0.01）。雙脈沖雖可提升至72.1%，但細胞存活率降至68.3%。280 V組出現明顯細胞聚集死亡現象。
2. 細胞活性分析
CCK-8結果顯示，260 V組轉染后24 h存活率為82.4±2.1%，48 h恢復至89.7%，表明電穿孔引起的膜損傷可快速修復。
3. 蛋白表達驗證
Western blot在48 h樣本中檢測到28 kDa清晰條帶，灰度分析顯示表達量隨時間遞增，72 h達到峰值。免疫熒光顯示EGFP均勻分布于細胞質，核周區域富集。
討論
本研究首次系統闡明電穿孔參數對大鼠肌衛星細胞轉染效率的影響機制：260 V電場強度可有效克服肌細胞膜高電阻特性，而5 ms脈沖時長平衡了質粒導入與膜結構穩定性。與傳統脂質體轉染（效率<30%）相比，電穿孔顯著提升外源基因表達量，且避免殘留載體干擾。值得注意的是，肌衛星細胞處于靜息狀態時膜膽固醇含量較高，可能影響電穿孔效率，后續研究可聯合去膽固醇預處理進一步優化。
結論
威尼德電穿孔儀在260 V/5 ms參數下可實現大鼠肌衛星細胞高效、低損傷轉染，EGFP表達穩定持續72 h以上。該方法克服了肌肉細胞轉染難題，為基因治療肌肉萎縮性疾病提供了可靠技術路徑。
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