在藥物研發(fā)的漫漫征途中，分子間相互作用的定量分析至關重要，快速尋找能夠精準結合目標分子的小分子抑制劑或促進劑，一直是科學家們不懈追求的目標。傳統(tǒng)的高通量篩選（HTS）技術雖能快速篩選大量化合物，但往往只能提供定性或半定量的結果，且存在大量假陽性和假陰性。傳統(tǒng)定量方法（SPR, BLI, ITC）通常需要重復測量稀釋系列，以便生成滴定曲線并測量平衡解離常數(shù)（Kd），但這些方法受限于它們在幾十分鐘范圍內(nèi)的中低通量能力，才可獲得單個配體的解離常數(shù)。其中表面等離子共振（SPR）、生物層干涉法（BLI）雖然能夠提供詳細的結合親和力和動力學信息，但基于表面的技術，需要復雜的表面化學優(yōu)化，且對緩沖液兼容性和分析物的表面吸附敏感；等溫滴定量熱法（ITC）雖然是溶液中的技術，但需要大量的樣品，對于珍貴或稀有的材料不夠實用，這些限制促使科學家們尋找更高效、更通用的分析技術。如今，一種名為cSPRING（Continuous Titration Based Spectral Related Intensity Change）的新興技術，它將FIDA（層流誘導分散分析）與光譜位移技術相結合，以在單個濃度樣品中測量Kd，作為一種溶液內(nèi)方法，可將樣品制備時間減少8倍，并且僅需要納克蛋白質。cSPRING可在一分鐘內(nèi)通過單濃度樣品測量Kd，突出了其效率和篩選應用的潛力，有望對傳統(tǒng)小分子定量篩選市場這一領域帶來新的曙光。

技術原理
在深入了解 cSPRING 的優(yōu)勢之前，我們先來剖析兩種技術——cSPRING 和 dSPRING 的實驗設計和原理。在 dSPRING（離散滴定法）中，研究人員需要準備一系列不同濃度的分析物溶液，通常通過 2 倍稀釋系列來實現(xiàn)。每個濃度點都需要單獨測量，生成完整的滴定曲線。實驗中，熒光標記的指示劑（如蛋白質）與不同濃度的配體混合后，通過Capflex方式進行檢測。熒光信號呈高斯分布，通過雙高斯擬合提取擴散系數(shù)和熒光強度，最終得到平衡解離常數(shù)（Kd）（Figure 1A）。

cSPRING（連續(xù)滴定法）技術基于FIDA（層流誘導分散分析）與光譜位移技術，通過在毛細管中自動創(chuàng)建連續(xù)的濃度梯度，實現(xiàn)對非共價相互作用的快速定量分析。具體來說，F(xiàn)IDA利用層流條件下熒光溶質的濃度分布，精確測定擴散系數(shù)和流體動力學半徑。而cSPRING結合了FIDA和光譜位移檢測，通過測量熒光團的發(fā)射光譜變化來反映分子間相互作用。實驗中只需準備兩個樣品：一個是完全結合狀態(tài)（高濃度分析物與指示劑混合），另一個是未結合狀態(tài)（僅指示劑）。通過在毛細管中自動創(chuàng)建連續(xù)的濃度梯度，模擬傳統(tǒng)的滴定曲線。配體在毛細管中以泰勒分散的方式形成時間依賴的濃度分布，而指示劑濃度保持恒定（Figure 1B）。
 

Figure 1 的展示，我們可以清晰地看到 cSPRING 和 dSPRING 在實驗設計上的關鍵區(qū)別。dSPRING 更適合高精度的詳細分析，而 cSPRING 則以其高效、快速的特點，成為高通量篩選的理想選擇。

應用案例
文章中，研究人員選擇了雞卵清溶菌酶（HEWL）與三乙酰氨基葡萄糖（NAG3）作為模型體系。HEWL被標記上對環(huán)境變化敏感的Cy5熒光染料，當NAG3與HEWL結合時，熒光團的微環(huán)境發(fā)生變化，導致其發(fā)射光譜的比率變化。通過在兩個光譜帶（λ1=663–685 nm和λ2=685–737 nm）中測量熒光強度的比率（F2/F1），研究人員能夠實時監(jiān)測結合過程。

Figure 2 展示了cSPRING技術在HEWL-NAG3體系中的應用。圖2A是一個dSPRING離散滴定曲線，顯示了在不同NAG3濃度下，HEWL與NAG3結合的比率熒光信號變化，擬合得到的Kd值為7.2±0.7 μM，與文獻報道的10 μM非常接近。圖2B則展示了cSPRING實驗中記錄的熒光信號，通過擬合得到的Kd值為10.4±0.8 μM，與dSPRING的結果一致。圖2C進一步驗證了cSPRING的重復性和可靠性，三次重復實驗的Kd值高度一致，平均值為10.4±0.8 μM。

為了進一步驗證 cSPRING 技術的高效性和準確性，研究人員選擇了牛碳酸酐酶 II（bCAII）作為模型體系。bCAII 是一種廣泛研究的酶，它與多種小分子抑制劑的相互作用已被詳細表征。

Figure 3 則展示了cSPRING技術在牛碳酸酐酶II（bCAII）與三種不同抑制劑（乙酰唑胺、呋塞米、4-羧基苯磺酰胺）體系中的應用。這些抑制劑的Kd值范圍從20 nM到1 μM，cSPRING技術能夠快速、準確地測定這些結合親和力，并與文獻報道的值高度一致。

Table 1 的數(shù)據(jù)表明，cSPRING 和 dSPRING 在測量非共價相互作用的解離常數(shù)（Kd）時具有高度一致性和可靠性。cSPRING 以其快速、高效、節(jié)省樣品的特點，特別適合高通量篩選和初步評估，而 dSPRING 則適合對單個體系進行更詳細的分析。這些方法與傳統(tǒng)技術（如 SPR 和 ITC）的比較進一步驗證了 cSPRING 的實用性和準確性。

為了進一步突出定量篩選能力，研究人員在更短的毛細管上進行 cSPRING 實驗，且無需額外的清洗步驟，這使得單個平衡解離常數(shù)（Kd）值的測量時間縮短至 45 秒（圖 4）。結果，對三種抑制劑進行三次重復測量用時不到 7 分鐘，每種抑制劑僅消耗 4.2 微升指示劑溶液。
 

Figure 4 在更短的毛細管中進行的 cSPRING 實驗，將單次測定平衡解離常數(shù)（Kd）的測量時間縮短至 45 秒。A - C 展示了三種不同抑制劑的 cSPRING 信號，以及擬合得到的平衡解離常數(shù)（Kd）和流體動力學半徑。盡管結果的準確性降低，但定量讀數(shù)提供了有價值的信息，并且仍與先前報道的親和力相符。

cSPRING的優(yōu)勢

1. cSPRING技術的核心優(yōu)勢在于其高通量、快速定量的能力。與傳統(tǒng)的滴定方法相比，顯著提高了實驗效率，由于該方法僅使用兩個樣品，樣品制備時間縮短為原來的八分之一。這為在 96 孔板中定量篩選大量小分子文庫騰出了空間。例如，兩個 96 孔板足以測定 150 多個平衡解離常數(shù)（Kd），而采用離散實驗設置則需要 1500 多個孔，需要大量的樣品制備工作和相當多的樣品量。
2. cSPRING技術對樣品的需求極低，僅需納克級的蛋白質，這對于珍貴或難以獲取的樣品具有重要意義。
3. cSPRING結合獨特的FIDA與光譜位移技術，一方面可在毛細管中自動創(chuàng)建連續(xù)的濃度梯度，避免了繁瑣的樣品準備過程，另一方面可避免單獨光譜位移技術容易受到背景熒光偽影的影響，而 cSPRING 通過分析高斯信號峰下的面積消除了這個問題，使其不受背景效應的影響。

結論
cSPRING技術以其高效、快速、精準的特點，為非共價相互作用的定量分析提供了一種全新的解決方案。它不僅大大減少了樣品準備時間和實驗成本，還能夠提供與傳統(tǒng)方法相媲美的準確結果。對于藥物研發(fā)中的高通量篩選和定量分析，cSPRING無疑是一個極具潛力的工具。

參考文獻
Philipp Willmer et al. "Continuous Titration Based Method for Rapid In‐Solution Analysis of Non‐Covalent Interactions." Chemistry Methods 2025.