ATCC微生物標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用挑戰(zhàn)與傳代管理規(guī)范探究
瀏覽次數(shù):121 發(fā)布日期:2025-4-17
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多年來,ATCC(美國典型培養(yǎng)物保藏中心)提供的微生物標(biāo)準(zhǔn)品已被CLSI(美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)研究所)和USP(美國藥典)等國際權(quán)威標(biāo)準(zhǔn)廣泛納入制藥及醫(yī)療質(zhì)量控制體系,廣泛應(yīng)用于產(chǎn)品質(zhì)控、對(duì)照實(shí)驗(yàn)及菌種鑒定。然而,盡管使用規(guī)范已高度成熟,實(shí)驗(yàn)室在傳代次數(shù)管理、非參考菌株傳代閾值界定等實(shí)操環(huán)節(jié)仍存在顯著挑戰(zhàn)。這一問題在制藥微生物領(lǐng)域?qū)I(yè)論壇(如PMFList)中持續(xù)引發(fā)討論,凸顯了制定統(tǒng)一操作框架的迫切性。
一、參考菌株命名差異與來源要求
參考菌株的命名差異加劇了實(shí)驗(yàn)室對(duì)微生物標(biāo)準(zhǔn)品管理的困惑。在CLSI和USP的各類文件中,這類培養(yǎng)物被分別稱為“對(duì)照菌株”“標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)物”“參考菌株”“測(cè)試菌株”或“質(zhì)量控制菌株”,其中“參考菌株”或“參考培養(yǎng)物”的稱呼較為普遍。
盡管這些術(shù)語常被混用,但兩個(gè)組織均強(qiáng)調(diào),參考菌株必須來源于權(quán)威機(jī)構(gòu),ATCC(美國典型培養(yǎng)物保藏中心)是主要的推薦來源,這為實(shí)驗(yàn)室選擇參考菌株提供了明確方向。
二、ATCC參考菌株的傳代培養(yǎng)體系
ATCC的參考菌株通過傳代培養(yǎng)制成“儲(chǔ)備培養(yǎng)物”,再通過每周或每月的定期傳代培養(yǎng)制成日常使用的“工作培養(yǎng)物”,工作培養(yǎng)物通常以斜面形式保存。然而,這種傳代培養(yǎng)方式引發(fā)了人們對(duì)其是否源自原始參考菌株的疑問。
(一)傳代計(jì)數(shù)規(guī)則的演變
核心爭(zhēng)議在于如何界定“一次傳代”的計(jì)數(shù)規(guī)則。
早期USP36-NF31<51>抗菌測(cè)試的原始定義為:“一次傳代指將生物體從已建立的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基的過程,所有轉(zhuǎn)移操作均計(jì)入傳代次數(shù)”。但未明確"已建立的培養(yǎng)物"的具體內(nèi)涵。
現(xiàn)行USP<1117>《微生物最佳實(shí)驗(yàn)室規(guī)范》對(duì)此進(jìn)行了重要修訂。更新后的定義為:“傳代指微生物從活體培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)基并實(shí)現(xiàn)增殖的過程,任何形式的傳代培養(yǎng)均視為一次轉(zhuǎn)種/傳代。”這一修訂有效解決了原定義的模糊性,根據(jù)新定義,ATCC冷凍或凍干菌株的解凍或水化操作不計(jì)入傳代,只有將其接種至新鮮培養(yǎng)基并完成生長(zhǎng)后才計(jì)為首次傳代。
因此,將ATCC冷凍或凍干小瓶中的參考菌株復(fù)蘇制備成儲(chǔ)備培養(yǎng)物屬于首次傳代,而將儲(chǔ)備培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種為工作培養(yǎng)物則構(gòu)成第二次傳代,后續(xù)每次轉(zhuǎn)種均累計(jì)增加傳代次數(shù)。通過統(tǒng)一術(shù)語和明確定義,為抗菌效果測(cè)試提供了清晰可追溯的傳代計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)。
在微生物實(shí)驗(yàn)室實(shí)踐中,除ATCC官方提供的標(biāo)準(zhǔn)菌株外,商業(yè)機(jī)構(gòu)常通過“ATCC衍生”方式獲得培養(yǎng)物——即從ATCC參考菌株出發(fā),經(jīng)過一次或多次傳代培養(yǎng)獲得的菌株。
(二)“ATCC衍生”培養(yǎng)物的管理
在微生物實(shí)驗(yàn)室實(shí)踐中,商業(yè)機(jī)構(gòu)常通過"ATCC衍生"方式獲得培養(yǎng)物,即從ATCC參考菌株經(jīng)一次或多次傳代培養(yǎng)所得。CLSI認(rèn)可符合資質(zhì)的商業(yè)菌株供應(yīng)商,但要求實(shí)驗(yàn)室必須關(guān)注菌株傳代歷程,從原始ATCC參考菌株到最終工作培養(yǎng)物,通常會(huì)經(jīng)歷1-2次傳代過程。
三、參考菌株管理的推薦系統(tǒng)與標(biāo)準(zhǔn)
(一)種子批系統(tǒng)的應(yīng)用
USP推薦采用種子批系統(tǒng)管理參考菌株,該系統(tǒng)與ATCC使用的系統(tǒng)一致。操作流程為:先將ATCC參考菌株一次性制備多個(gè)重復(fù)傳代培養(yǎng)物,這些源自同一代原種的重復(fù)培養(yǎng)物作為實(shí)驗(yàn)室的初代種子庫存儲(chǔ);再將初代種子培養(yǎng)物傳代至第二代,用于制備工作菌株的多批次培養(yǎng)物,以此規(guī)范實(shí)驗(yàn)室參考菌株的保存流程。(圖1)

(二)傳代次數(shù)控制標(biāo)準(zhǔn)
不同標(biāo)準(zhǔn)對(duì)傳代次數(shù)的要求存在顯著差異。CLSI早期標(biāo)準(zhǔn)對(duì)傳代頻次要求模糊,后續(xù)修訂版提出三級(jí)傳代限制,但推算后原始菌株累計(jì)傳代可能達(dá)七次。而USP標(biāo)準(zhǔn)通過<1117>章節(jié)明確規(guī)定,實(shí)驗(yàn)室工作培養(yǎng)物與ATCC參考菌株的傳代差值不得超過五次,<51>條款強(qiáng)調(diào)“檢測(cè)用活體微生物不得超出原始ATCC菌株五代傳代” ,這一量化標(biāo)準(zhǔn)被制藥行業(yè)廣泛采用,ATCC官方也確認(rèn)五代傳代限制是維持菌株遺傳穩(wěn)定性的最佳實(shí)踐。
(三)儲(chǔ)存溫度與維護(hù)要求
菌株的儲(chǔ)存溫度對(duì)其生物學(xué)特性及存活率具有顯著影響,各標(biāo)準(zhǔn)機(jī)構(gòu)對(duì)此給出了詳細(xì)指引。
1、CLSI標(biāo)準(zhǔn)
(1)原代培養(yǎng)物:
短期保存:-50℃至-70℃保存1年。
長(zhǎng)期保存:-70℃以下。
延長(zhǎng)儲(chǔ)存:-20℃或更低溫度(優(yōu)先推薦-70℃以下)
(2)工作培養(yǎng)物(斜面):
短期保存:2-8℃環(huán)境,保存周期≤4周。
2、USP36-NF31<51>條款
(1)培養(yǎng)物:必須儲(chǔ)存于液氮或-50℃以下的機(jī)械冷凍設(shè)備。
3、ATCC標(biāo)準(zhǔn)
(1)冷凍菌株:
長(zhǎng)期保存:液氮?dú)庀喹h(huán)境或-80℃機(jī)械冷凍箱(避免直接浸入液氮)。
甘油保護(hù)劑:含50%甘油的菌株可短期保存于-20℃(≤1個(gè)月),需避免溫度波動(dòng)(如反復(fù)凍融)。
(2)凍干菌株:2-8℃保存。
(3)凍干菌株(斜面):2-8℃保存≤1周。
4、特殊注意事項(xiàng)
質(zhì)控菌株(如攜帶耐藥基因質(zhì)粒):需嚴(yán)格遵循CLSI最新標(biāo)準(zhǔn)。